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Abstract

作為一類重要的貝類，牡蠣可引發(fā)嚴重的過敏反應(yīng)。本研究旨在鑒定并表征太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中的主要過敏原，并闡明其致敏性及交叉反應(yīng)性的分子機制。天然及重組太平洋牡蠣精氨酸激酶（AK）均表現(xiàn)出顯著的免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白E（IgE）結(jié)合活性。熱處理及強酸性、強堿性條件可降低太平洋牡蠣AK的IgE結(jié)合活性。此外，研究證實了精氨酸激酶在不同貝類物種間存在交叉反應(yīng)性。在本研究鑒定出的7個表位肽中，P2肽段決定太平洋牡蠣AK的特異性，而P3肽段則介導(dǎo)軟體動物與甲殼類動物間的交叉反應(yīng)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，輕鏈中的谷氨酸98（Glu98）、組氨酸 31（His31）以及重鏈中的精氨酸 101（Arg101）、賴氨酸 57（Lys57）是識別表位過程中的關(guān)鍵IgE結(jié)合殘基。這些研究結(jié)果為貝類過敏的預(yù)防與治療，以及低致敏性貝類產(chǎn)品的研發(fā)提供了新的思路。

Introduction

貝類過敏是一種典型的IgE介導(dǎo)的食物過敏，在美國，其在兒童中的發(fā)病率為0.06%～2.00%，在成人中的發(fā)病率為1.69%～9.00%。軟體動物是貝類中的重要類別，包含牡蠣、扇貝、蛤蜊、鳥蛤和貽貝等。其中，牡蠣是人類健康飲食的重要組成部分，也是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源。在全球范圍內(nèi)，牡蠣（尤其是太平洋牡蠣）的產(chǎn)量和消費量逐年遞增。然而，軟體動物可能誘發(fā)IgE介導(dǎo)的食物超敏反應(yīng)，進而引發(fā)嚴重的過敏癥狀，包括哮喘、蕁麻疹、胃腸道痙攣，甚至休克。據(jù)統(tǒng)計，美國兒童群體中軟體動物過敏的患病率約為0.15%，東南亞地區(qū)為0.2%，法國則超過1.5%。盡管如此，目前針對軟體動物過敏的研究仍較為匱乏。

迄今為止，世界衛(wèi)生組織與國際免疫學(xué)會聯(lián)合會（WHO/IUIS）已將原肌球蛋白（TM）列為軟體動物物種中的過敏原，例如太平洋牡蠣（過敏原編號Cra g 1）和美洲牡蠣（過敏原編號Sac g 1）。原肌球蛋白是一種鹽溶性、熱穩(wěn)定性的肌原纖維蛋白，分子量為34～36 kDa，已被證實是貝類中主要的IgE結(jié)合型過敏原。然而，以往研究表明軟體動物中還存在其他過敏原，這些過敏原仍需進一步鑒定與研究。鑒于太平洋牡蠣的年產(chǎn)量與消費量逐年增加，迫切需要對其主要過敏原進行分析，以更深入地了解牡蠣過敏機制，并加強牡蠣過敏原的管理工作。

已有研究報道，在對蝦過敏人群中，軟體動物（鮑魚、海螺、貽貝、櫛江珧、蛤蜊、烏賊、魷魚和章魚）與甲殼類動物（對蝦、龍蝦和螃蟹）之間存在交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)性的產(chǎn)生，取決于不同貝類物種中共同過敏原的高序列相似性及相似的構(gòu)象表位。TM已被證實是貝類中的共同過敏原，也是導(dǎo)致牡蠣與甲殼類動物間產(chǎn)生交叉反應(yīng)性的關(guān)鍵物質(zhì)。然而，此類交叉反應(yīng)性可能涉及軟體動物與甲殼類動物中大部分的共同過敏原。AK被認為是多種甲殼類動物中的另一類主要過敏原，同樣參與介導(dǎo)軟體動物與甲殼類動物間的交叉反應(yīng)性。目前已觀察到螃蟹AK與章魚、螯蝦及對蝦AK之間存在交叉反應(yīng)性，但貝類物種間交叉反應(yīng)性的分子機制仍不明確。免疫學(xué)研究表明，線性表位和構(gòu)象表位共同決定了過敏原的免疫原性，這為進一步理解交叉反應(yīng)性提供了思路。

在本研究中，研究人員利用牡蠣過敏患者的血清，對太平洋牡蠣蛋白質(zhì)提取物的IgE結(jié)合反應(yīng)性進行了譜圖分析。通過質(zhì)譜分析，將一種具有IgE反應(yīng)性的40 kDa蛋白質(zhì)鑒定為肌肉蛋白—AK。為更深入地了解太平洋牡蠣AK，研究人員分析了該牡蠣過敏原AK的理化特性（如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、IgG/IgE結(jié)合活性及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）。此外，研究還評估了太平洋牡A(chǔ)K與其他甲殼類動物AK的交叉反應(yīng)性，并進一步模擬了IgE與太平洋牡蠣AK之間的分子相互作用，旨在為太平洋牡蠣過敏及甲殼類動物交叉反應(yīng)性提供理論依據(jù)。

Results

C. gigas中的特異性IgE反應(yīng)譜

本研究通過Western blot測定了牡蠣蛋白質(zhì)的IgE結(jié)合能力。首先采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）在生牡蠣蛋白質(zhì)提取物中觀察到16條蛋白質(zhì)條帶，分子量范圍約為16～210 kDa。此外，利用6份牡蠣過敏患者血清，通過Western blot測定了這16條蛋白質(zhì)條帶的IgE結(jié)合能力。在圖1A中共觀察到9條具有IgE反應(yīng)性的條帶，對應(yīng)分子量分別為18、38、40、55、70、90、95、100和120 kDa的蛋白質(zhì)。其中，40 kDa蛋白質(zhì)的致敏概率最高（6份血清中有5份可與其結(jié)合），提示該40 kDa蛋白質(zhì)可能是太平洋牡蠣中的主要過敏原。

為鑒定該40 kDa蛋白質(zhì)，研究人員切取了分子量為40 kDa的IgE結(jié)合條帶，并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對其進行分析。在UniProt數(shù)據(jù)庫的牡蠣（C. gigas）子庫中，該40 kDa蛋白質(zhì)共產(chǎn)生20條有效肽段，這些肽段與AK（登錄號：K1PLF9）匹配，且與AK的比對氨基酸序列一致性達70%。因此，在C. gigas中，AK具有最高的IgE結(jié)合能力。

圖1 牡蠣過敏患者對C. gigas蛋白質(zhì)提取物的IgE反應(yīng)模式及C. gigas-nAK與C. gigas-rAK的IgG/IgE結(jié)合活性

C. gigas-AK的純化與表達

天然精氨酸激酶（nAK）通過DEAE-Sepharose純化獲得：一條分子量為40 kDa的AK單一條帶。重組精氨酸激酶（rAK）經(jīng)大腸桿菌 BL21（E. coli BL21）表達獲得，其純度可達95%以上。

AK是太平洋牡蠣中的主要過敏原

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和Western blot對C. gigas-nAK和rAK的IgE和IgG結(jié)合活性進行了分析，發(fā)現(xiàn)C. gigas-AK具有顯著的IgE和IgG結(jié)合能力，該結(jié)果與Western blot的分析結(jié)果一致。在圖1C中，nAK和rAK均呈現(xiàn)出清晰的陽性條帶，而牛血清白蛋白（BSA）與混合陽性血清及anti-AK mAb均未發(fā)生反應(yīng)。因此，可得出結(jié)論，AK是C. gigas中的主要過敏原。

C. gigas-nAK的二級結(jié)構(gòu)

nAK的二級結(jié)構(gòu)組成如下：α-螺旋占比63.4%、延伸鏈占比3.3%、β-轉(zhuǎn)角占比15.4%、無規(guī)卷曲占比17.9%。nAK中芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸）含量較低。

C. gigas-nAK的特性分析

如圖2A所示，當溫度從65 ℃升高至100 ℃時，nAK的IgE結(jié)合活性逐漸下降。在pH穩(wěn)定性分析中，nAK的IgE結(jié)合活性在弱酸性與弱堿性條件下（pH 6.0～9.0）相對穩(wěn)定；然而，在強酸性（pH 1.0～3.0）與強堿性條件下（pH 10.0～11.0），nAK的IgE結(jié)合活性顯著下降（圖2B）。

圖2C. gigas-nAK的特性分析

不同物種AK的交叉反應(yīng)性分析

如圖2C所示，C. gigas-nAK含有可結(jié)合蝦特異性IgE的大部分IgE結(jié)合表位。

如圖2D所示，所有物種可分為2個聚類：軟體動物類（牡蠣與章魚）和節(jié)肢動物類（蟹、蝦、龍蝦及蟑螂），這表明C. gigas-nAK與中國槍烏賊及普通章魚的AK親緣關(guān)系更近。

IgE識別表位的分子機制

體外實驗驗證結(jié)果顯示，這7個C. gigas-AK表位均能在嵌合IgE的抗原識別位點與IgE結(jié)合（圖3）。IgE與P3表位的結(jié)合作用最強，原因是二者相互作用時可掩埋145.2 ?2的表面積，且該表位肽的彎曲程度最大—其N端與C端的距離縮短了39.8 ?。值得注意的是，所有表位肽與IgE結(jié)合后均未表現(xiàn)出β-折疊或平面結(jié)構(gòu)特征，這與以往的研究結(jié)論存在差異。

圖3 C. gigas-AK表位肽與嵌合IgE的詳細相互作用

不同處理方式對表位構(gòu)象的影響

如圖4顯示，經(jīng)熱處理后，7個C. gigas-AK表位均發(fā)生結(jié)構(gòu)變化：其RMSD值范圍為1.384～4.783 ?，溶劑可及表面積（SASA）變化范圍為減少40.92 ?2至增加27.17 ?2。經(jīng)酸性處理后，這些表位同樣發(fā)生結(jié)構(gòu)變化：RMSD值范圍為1.820～4.604 ?，SASA變化范圍為減少90.85 ?2至增加41.73 ?2。而經(jīng)熱酸聯(lián)合處理后，表位的結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)為：RMSD值范圍為2.191～4.332 ?，SASA變化范圍為減少32.6 ?2至增加11.5 ?2。總體而言，熱酸聯(lián)合處理會導(dǎo)致這些表位肽的結(jié)構(gòu)偏差更顯著，而單獨熱處理則會使表位的SASA暴露程度更高。

圖4無配體結(jié)合（apo-）及IgE結(jié)合狀態(tài)下C. gigas-AK天然表位肽與處理后表位肽的結(jié)構(gòu)比對

Discussion

隨著牡蠣產(chǎn)量的增加及大規(guī)模消費，由軟體動物引發(fā)的過敏反應(yīng)也隨之增多。然而，目前針對軟體動物（尤其是最常見的牡蠣品種—C. gigas中致敏蛋白的研究尚為數(shù)不多。本研究利用牡蠣特異性IgE，對C. gigas中的潛在致敏蛋白進行了篩選與鑒定。在免疫印跡分析中，9條具有IgE反應(yīng)性的條帶里，經(jīng)鑒定為AK的40 kDa蛋白質(zhì)展現(xiàn)出最高的致敏概率（6份過敏血清中有5份可與其結(jié)合），這表明AK是C. gigas中的主要致敏蛋白。因此，本研究將重點聚焦于C. gigas-AK。研究人員純化得到nAK，并在大腸桿菌（E. coli）中表達獲得rAK。免疫印跡與ELISA結(jié)果顯示，rAK的IgE和IgG結(jié)合活性均強于nAK?？赡艿慕忉屖牵琻AK的翻譯后修飾掩蓋了其IgE和IgG結(jié)合位點。上述結(jié)果證實，AK確實是C. gigas中的一種致敏原。

此外，已有研究表明，精氨酸激酶在章魚、甲殼類動物及蟑螂中均為重要致敏原。因此，AK可被認定為C. gigas中的主要致敏原，該發(fā)現(xiàn)為牡蠣過敏的預(yù)防與治療提供了新的思路。

通過牡蠣特異性IgE和蝦特異性IgE的icELISA可知，牡蠣與甲殼類動物之間存在交叉反應(yīng)。有趣的是，C. gigas-AK與蝦特異性IgE的結(jié)合活性，強于甲殼類動物AK與牡蠣特異性IgE的結(jié)合活性。其原因可能是，患者在攝入牡蠣或蝦后，血清中牡蠣特異性IgE的水平通常顯著低于蝦特異性IgE的水平。這些研究結(jié)果表明，C. gigas-AK包含了其他甲殼類動物AK上存在的大部分IgE結(jié)合表位。因此，我們對C. gigas-AK表位肽與蝦特異性IgE之間的分子相互作用展開了研究。研究發(fā)現(xiàn)，線性表位P3與蝦特異性IgE的結(jié)合親和力最高，而表位P2則具有最強的牡蠣特異性IgE結(jié)合能力。這很可能是因為，位于AK保守區(qū)域的表位P3，在多種甲殼類動物中也被鑒定為表位，這表明P3在C. gigas-AK與甲殼類動物AK的交叉反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。相反，位于非保守區(qū)域的表位P2，則被證實是C. gigas-AK特異性的重要表位。

以往研究證實，大多數(shù)過敏原在不同溫度或pH值條件下仍能保持免疫反應(yīng)性。對nAK的熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性研究表明，C. gigas-AK穩(wěn)定性較差，在高溫（＞65 ℃）及強酸堿條件下會發(fā)生降解，進而導(dǎo)致其IgE結(jié)合活性下降。然而，本研究同樣觀察到，經(jīng)酸性和熱處理后，nAK仍保留一定的免疫原性。其原因可能是不同處理方式會導(dǎo)致構(gòu)象表位發(fā)生不同變化，同時也會對部分線性表位產(chǎn)生影響。在本研究中，通過計算機模擬發(fā)現(xiàn)，加熱會降低C. gigas-AK表位的免疫原性，且大多數(shù)表位肽的免疫原性也會隨之下降。體外實驗顯示，酸性處理同樣會降低其免疫原性；同時計算機模擬結(jié)果也表明，大多數(shù)表位肽與IgE的結(jié)合親和力會因酸性處理而降低。已有研究指出，加熱（尤其是煮沸）會降低蝦提取物與IgE的結(jié)合能力，但會增強煮沸后蝦體內(nèi)純化的TM與IgE的結(jié)合能力。因此，具體的加熱和酸性處理方式可能需根據(jù)每個表位肽的序列及其在AK上的位置來確定，這為低致敏性貝類產(chǎn)品的研發(fā)提供了新的思路。

通過計算分析發(fā)現(xiàn)，輕鏈中的Glu98和His31，以及重鏈中的Arg101和Lys57，是通過氫鍵作用識別表位的關(guān)鍵IgE殘基。而輕鏈中的Glu98、Thr99、Tyr37、His31、Leu97，以及重鏈中的Ala104、Thr105、His59、Lys57，則是通過疏水相互作用識別表位的關(guān)鍵IgE殘基。其中，在所有檢測條件下，輕鏈中的Glu98不僅能與C. gigas-AK的所有表位形成氫鍵，還能與這7個表位均形成疏水相互作用，這表明該殘基在IgE識別甲殼類動物表位的過程中發(fā)揮著核心作用。該Glu98來源于一名中國蝦過敏患者的IgE序列。

Conclusion

綜上所述，本研究證實AK是C. gigas中的主要過敏原，這表明AK可用于軟體動物過敏患者的體外診斷。此外，牡蠣與甲殼類動物AK之間存在的交叉反應(yīng)，為貝類過敏的預(yù)防與治療提供了新的思路。再者，熱處理及強酸堿處理可降低AK的免疫原性，這為低致敏性貝類產(chǎn)品的研發(fā)提供了指導(dǎo)依據(jù)。

Molecular basis of the allergenicity and cross-reactivity of a major allergen-Crassostrea gigas arginine kinase

Yanbo Wanga,1, Peiao Zhangb,1, Jinru Zhoua, Jihui Gaob, Jinlyu Sunc, Di Wud, Wentong Xueb, Dong Yangb,*, Linglin Fua,*

a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

b College of Food Science & Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

c Allergy Department, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

d Institute for Global Food Security, School of Biological Sciences, Queen’s University of Belfast, Belfast BT9 5DL, United Kingdom

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

As an important shellfish group, the oyster can induce severe allergic reactions. We aimed to identify and characterize the major allergen in Crassostrea gigas, and elucidate the molecular basis of its allergenicity and cross-reactivity. The native and recombinant C. gigas-arginine kinase (AK) displayed significant immunoglobulin (Ig)G- and IgE-binding activity. The IgE-binding activity of C. gigas-AK could be reduced by thermal treatment and strong acidic and alkaline conditions. Besides, cross-reactivity of AK was demonstrated between shellfish species. Among seven epitope peptides identified here, P2 is responsible for the specificity of C. gigas-AK, while P3 is responsible for cross-reactions between mollusks and crustaceans. Furthermore, Glu98 and His31 in the light chain, Arg101, and Lys57 in the heavy chain are identified as key IgE residues in recognizing epitopes. These findings provide new insights into the prevention and treatment of shellfish allergy and the development of hypoallergenic shellfish products.

Reference:

WANG Y B, ZHANG P A, ZHOU J R, et al. Molecular basis of the allergenicity and cross-reactivity of a major allergen-

Crassostrea gigas

翻譯： 王立磊（實習(xí)）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意