甜蛋白是一類天然存在的甜味蛋白質(zhì)，其甜度是等濃度蔗糖的千倍甚至萬倍，同時(shí)熱量低、甜味持續(xù)時(shí)間長且可被降解為氨基酸以供人體吸收利用，在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前已從自然界的植物中分離出了8 種甜味蛋白，分別為Brazzein、Monelin、Thaumatin、Mabinlin、Pentadin、Curculin、Miraculin與Neoculin。

Brazzein，中文被譯為布拉奇因或巴西甜蛋白，是1994年從非洲西部野生植物

Pentadiplandra brazzeana

Baillon的果實(shí)中分離提純出的一種甜味蛋白質(zhì)。Brazzein由54 個(gè)氨基酸殘基組成，包含8 個(gè)半胱氨酸，分子質(zhì)量為6.5 kDa，其甜度約為等質(zhì)量蔗糖的2 000 倍，同時(shí)具有良好的水溶性。由于Brazzein只能從野生植物的果實(shí)中提取得到，且其在果實(shí)中的含量較低，傳統(tǒng)種植提取手段成本高昂，因此通過基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)天然甜味蛋白的異源表達(dá)愈發(fā)受到關(guān)注，目前研究者們已經(jīng)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了Thaumatin的表達(dá)，但會(huì)導(dǎo)致蛋白以包涵體的形式存在，需要進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)性；Monellin則由重組畢赤酵母在5 L生物反應(yīng)器中發(fā)酵產(chǎn)生，產(chǎn)量達(dá)到了2.45 g/L，可以認(rèn)為真核生物是異源表達(dá)甜味蛋白的理想系統(tǒng)。

南京工業(yè)大學(xué)的高鵬、張勝夢、李莎*等通過優(yōu)化畢赤酵母

Komagataella phaffii

GS115表達(dá)系統(tǒng)和搖瓶水平優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)條件，并進(jìn)行啟動(dòng)子篩選實(shí)驗(yàn)、信號肽適配性驗(yàn)證與共表達(dá)蛋白表達(dá)調(diào)控元件以進(jìn)一步提高Brazzein產(chǎn)量。最后在5 L發(fā)酵罐中，對發(fā)酵工藝與培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期為Brazzein的工業(yè)化生產(chǎn)提供高效技術(shù)方案。

1 構(gòu)建異源表達(dá)Brazzein的重組畢赤酵母與搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Bra（圖1a），電轉(zhuǎn)獲得大量轉(zhuǎn)化子，提取其基因組后對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果在650 bp處均顯示目的條帶，測序結(jié)果證明無誤，表明

Brazzein

基因被成功整合到畢赤酵母GS115基因組上（圖1b）。重組工程菌 進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，離心取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，在6.5 kDa處有明顯的蛋白條帶，與 理論分子質(zhì)量大小一致（圖1c）。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，為Brazzein的特征肽段。以上結(jié)果證實(shí)，畢赤酵母異源表達(dá)Brazzein的陽性轉(zhuǎn)化子

K. phaffii Bra

-1成功獲得。

K. phaffii Bra

-1表達(dá)甜味蛋白Brazzein的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化。甲醇誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為2.0%時(shí)，雖然生物量不是最高，但蛋白質(zhì)量濃度可達(dá)到80.8 mg/L，相比0.5%誘導(dǎo)的產(chǎn)量提升了217.5%（圖1d）；初始生物素體積分?jǐn)?shù)為0.08%時(shí)蛋白表達(dá)量最高，為82.4 mg/L，且可以保持最高的生物量（圖1e）；發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)Brazzein表達(dá)量最高，達(dá)到85.1 mg/L，過高或者過低的溫度都不適宜異源蛋白的表達(dá)與生物量的積累（圖1f）；BMMY培養(yǎng)基的初始pH值為6.0時(shí)最適宜重組菌生長與目的蛋白表達(dá)，表達(dá)量提高至90.2 mg/L，實(shí)現(xiàn)了蛋白表達(dá)與生物量積累的平衡（圖1g）。經(jīng)4 個(gè)單因素的發(fā)酵條件優(yōu)化，Brazzein在搖瓶水平上表達(dá)量提升了254.3%。

2 Brazzein異源表達(dá)的啟動(dòng)子優(yōu)化

基于畢赤酵母

K. phaffii

GS115基因組和文獻(xiàn)報(bào)道，挖掘獲得6 種內(nèi)源性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（PAOX1、PCAT1、PADH3、PFLD1、PDAS1、PFDH1）和3 種內(nèi)源性組成型啟動(dòng)子（PGAP、PKAR2-1U＋GCW、PKAR2-3U＋GCW），構(gòu)建了目的基因

Brazzein

的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-pro-

Bra

（圖2a），并轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組菌

K. phaffii Bra

-1～9。在誘導(dǎo)表達(dá)后取樣檢測OD600和發(fā)酵上清液的蛋白質(zhì)量濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2b所示，各啟動(dòng)子優(yōu)化菌株的蛋白表達(dá)效率如圖2c所示。發(fā)酵結(jié)果表明經(jīng)過120 h的誘導(dǎo)后，PAOX1優(yōu)化菌株的Brazzein表達(dá)量最高，達(dá)到90.21 mg/L，且生物量最低，

K. ph

affii Bra

-1重組菌具有最強(qiáng)的單位菌體表達(dá)水平，這也預(yù)示著PAOX1在后續(xù)菌株改造中最富有潛力，劉超等使用PAOX1與其他6 種強(qiáng)啟動(dòng)子異源表達(dá)人源III型膠原蛋白，結(jié)果表明PAOX1較其他強(qiáng)啟動(dòng)子具有更高的表達(dá)效率與濃度，本研究結(jié)論基本與其相符。相比之下，PADH3、PFLD1和PCAT1表達(dá)效果均不佳，這可能由于不同啟動(dòng)子與目的蛋白的適配性有關(guān)。因此，后續(xù)仍然以PAOX1作為Brazzein誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的菌株

K. phaffii Bra

-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 Brazzein異源表達(dá)的信號肽適配性優(yōu)化

信號肽是位于蛋白質(zhì)N端的一段氨基酸序列，在蛋白分泌表達(dá)中扮演著至關(guān)重要的角色。經(jīng)挖掘得到6 個(gè)外源信號肽（Sα-factor、SαΔ57-70、SLysozyme、SeSIG、Sost1、Sost1-proα）和3 個(gè)內(nèi)源信號肽（Sdan4、Sdddk、Smsb2）（圖3a），分別構(gòu)建重組菌

K. phaffii Bra

-10～17。結(jié)果表明（圖3b、c），S α-factor 、S ost1-proα 、S Lysozyme 、S eSIG 和S msb2 對Brazzein的分泌表達(dá)效果基本一致，表達(dá)量均在79.5～85.8 mg/L之間。而重組菌K. phaffii Bra-11上基于S α-factor 改造的S αΔ57-70 表達(dá)量最佳，達(dá)到183.2 mg/L，相比S α-factor 的表達(dá)水平提高了約113%，且生物量可以維持在一個(gè)較高的水平。S α-factor 第57～70氨基酸的突變使信號肽中第3段

-螺旋部分缺失，增加了信號肽環(huán)區(qū)的柔性，該柔性有利于信號肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體更好地相互作用，且信號肽能夠更有效地與新合成蛋白質(zhì)相互作用，幫助它正確高效地進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，從而促進(jìn)蛋白的表達(dá)。相較于S α-factor 改造策略，S ost1-proα 的組合式改造策略也有所提高，S ost1-proα 是通過將S α-factor 的前區(qū)序列替換為S ost1 的前區(qū)序列，相比原始S ost1 能夠更有效地促進(jìn)目的蛋白質(zhì)的翻譯后轉(zhuǎn)位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而提高分泌效率，但在本研究中表達(dá)量仍與S α-factor 相差不大。另外，2 個(gè)內(nèi)源信號肽S dan4 和S dddk 不適用于Brazzein的分泌表達(dá)，相比S α-factor 下調(diào)62.5%和53.7%。因此，選取以S αΔ57-70 替代S α-factor 作為Brazzein的分泌信號肽的重組菌

K. phaffii Bra

-11進(jìn)行下一步研究。

4 蛋白結(jié)構(gòu)修飾及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力釋放對Brazzein異源表達(dá)的影響

蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）能夠催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成、斷裂和重排，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊；轉(zhuǎn)錄因子Hac1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)時(shí)，被激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊相關(guān)基因的表達(dá)；伴侶蛋白BiP在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過程中發(fā)揮重要作用，防止新合成的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中變性或斷裂，3 種蛋白表達(dá)調(diào)控元件在蛋白分泌表達(dá)過程中的具體機(jī)制如圖4a所示。

K. phaffii Bra

-11作為對照菌株，與分別整合分子伴侶和轉(zhuǎn)錄因子PDI、Hac1、BiP的

K. phaffii Bra

-18～20菌株進(jìn)行比較。對照菌株表達(dá)量為175.1 mg/L，整合PDI的菌株

K. phaffii Bra

-18表達(dá)量為209.3 mg/L，相比之下提升19.5%，而整合

Hac1

BiP

的菌株

K. phaffii Bra

K. phaffii Bra

-20表達(dá)量變化不顯著，且3 種分子伴侶和轉(zhuǎn)錄因子對于生物量的影響也不顯著（圖4b、c）。PDI可以通過催化二硫鍵的形成和異構(gòu)化，幫助異源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊，從而提高蛋白的表達(dá)量，如共表達(dá)PDI可以使抗體蛋白2F5 Fab在畢赤酵母中的表達(dá)水平提高2 倍，因此選擇重組菌

K. phaffii Bra

-18進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵罐放大驗(yàn)證，以評估其在高密度發(fā)酵中的生長性能和產(chǎn)物生成能力。

5 5L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)表達(dá)Brazzein工藝優(yōu)化

5.1 甲醇誘導(dǎo)起始生物量對Brazzein表達(dá)量的影響

通過調(diào)整甘油補(bǔ)料時(shí)間的長短控制誘導(dǎo)前發(fā)酵罐中畢赤酵母的生物量（以O(shè)D600表征），以重組工程菌

K. phaffii Bra

-18為研究對象，考察不同初始生物量（OD 600 ＝100或200）進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)對Brazzein表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)起始OD 600 為200時(shí)，表達(dá)量可在108 h到達(dá)峰值，約為0.7 g/L，而當(dāng)誘導(dǎo)起始OD 600 為100時(shí)，蛋白前期積累速度較慢，但表達(dá)量可以在114 h達(dá)到約1.0 g/L，并且在相同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)蛋白的速率均為最高（圖5）。這表明起始生物量較高并不一定能提高異源蛋白的表達(dá)量，即使在誘導(dǎo)初期效果也不一定好，這可能由于畢赤酵母高密度發(fā)酵對于DO的要求較高，生物密度大造成傳氧受阻。因此，后續(xù)研究中甲醇誘導(dǎo)起始生物量OD 600 定為100。

5.2 發(fā)酵過程pH值調(diào)控對Brazzein表達(dá)量的影響

研究表明，畢赤酵母適宜生長的pH值較為寬廣，在pH 3～7的范圍內(nèi)均能保持良好的生長趨勢，但為了高效表達(dá)異源蛋白，發(fā)酵pH值一般控制在6左右。因此，本研究在確定初始生物量的基礎(chǔ)上，通過流加氨水控制發(fā)酵過程pH值分別為4、5、6和7，考察其對

K. phaffii Bra

-18菌株表達(dá)Brazzein產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，pH 4、5、6和7的最高表達(dá)量分別為1、1.4、1.1、0.9 g/L（圖6）。這表明pH值遠(yuǎn)離7時(shí)，促進(jìn)Brazzein的分泌表達(dá)，這可能是由于Brazzein的等電點(diǎn)為6.98，發(fā)酵液pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)有利于Brazzein的可溶性表達(dá)。但過于酸性的環(huán)境，降低了重組菌在發(fā)酵后期（96～126 h）的生長狀態(tài)與蛋白表達(dá)量，其OD 600 值低于pH值為6時(shí)的數(shù)值。因此，選擇將發(fā)酵過程pH值控制在5。

5.3

K. phaffii Bra

-18菌株高密度發(fā)酵表達(dá)Brazzein的生產(chǎn)初探

由于BMGY培養(yǎng)基中含有酵母提取物、YNB、蛋白胨等昂貴的氮源，規(guī)模化生產(chǎn)培養(yǎng)基成本較高，而BSM培養(yǎng)基成分則相對簡單，主要包含無機(jī)鹽、甘油等基本營養(yǎng)物質(zhì)，可以顯著降低原料成本。以重組工程菌

K. phaffii Bra

-18為研究對象，根據(jù)上述優(yōu)化的條件采用BSM培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵的研究，結(jié)果如圖7所示，可以在126 h獲得1.2 g/L的產(chǎn)量，略低于BMGY培養(yǎng)基的表達(dá)效果，但可以實(shí)現(xiàn)更高的生物量積累，如若后期再進(jìn)行適配性代謝及發(fā)酵過程優(yōu)化，那么使用BSM工業(yè)化培養(yǎng)基生產(chǎn)甜味蛋白Brazzein的潛力很大，另一方面也表明本研究創(chuàng)制的這株重組菌具有多元的發(fā)酵適應(yīng)性，可適用于多種培養(yǎng)基配方。

通過畢赤酵母宿主表達(dá)體系組合優(yōu)化及發(fā)酵過程強(qiáng)化，本研究在5 L生物反應(yīng)器中，以BMGY和BSM為培養(yǎng)基，通過分批補(bǔ)料策略，分別獲得1 440、1 220 mg/L的Brazzein表達(dá)量，相較于搖瓶水平使用

K. lactis

GG799作為表達(dá)宿主的104 mg/L表達(dá)量和發(fā)酵罐水平使用

K. phaffii

GS115作為表達(dá)宿主的1 000 mg/L表達(dá)量提升明顯（表2）。

5.4 重組Brazzein的純化與鑒定

因?yàn)榘l(fā)酵液上清在50 kDa附近存在一定的雜蛋白條帶，所以離心后取上清液，使用分子質(zhì)量10 000 kDa的超濾管截留剩余雜蛋白，通過圖8可知，最終可以獲得純度較高的目的蛋白。

質(zhì)譜分析結(jié)果中匹配到4 條注釋序列：CQLANQCNYDCK、KVYENYPVSK、SGECFYDEKR、VYENYPVSKCQLANQCNYDCK（表3），序列覆蓋度為94%，說明畢赤酵母中表達(dá)的蛋白與目標(biāo)蛋白Brazzein相匹配。

隨機(jī)提供給志愿者A、B、C、D、E 5 種樣品，對不同質(zhì)量濃度的重組蛋白Brazzein和蔗糖進(jìn)行雙盲感官檢驗(yàn)，通過排序法按照甜度高低對樣品進(jìn)行排序。由評價(jià)結(jié)果可知（表4），有8 名志愿者認(rèn)為75 μg/mL的蛋白樣品溶液甜度與10 000 μg/mL蔗糖無明顯差異，因此計(jì)算可得重組蛋白Brazzein的甜度約為等質(zhì)量蔗糖的150 倍，與目前已知最高產(chǎn)量為等質(zhì)量蔗糖的40 倍的甜度結(jié)果相比，本研究結(jié)果較其提升275%。另外，雖有2 位志愿者認(rèn)為重組蛋白Brazzein的甜度介于100～150 倍之間，但其后味與持久性顯著強(qiáng)于蔗糖。目前已知甜味蛋白Brazzein甜度約為等質(zhì)量蔗糖的2 000～3 000 倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其存在一定差距，可能的原因是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)存在的糖基化修飾，會(huì)影響眾多外源蛋白的活性，另外甜味蛋白的甜味依賴其正確的構(gòu)型，共表達(dá)PDI后雖然可以實(shí)現(xiàn)甜味蛋白Brazzein的高效表達(dá)，但仍缺少其構(gòu)型與天然來源蛋白構(gòu)型的對比，這依賴于異源重組表達(dá)與天然表達(dá)Brazzein的晶體結(jié)構(gòu)差異分析，后續(xù)也需要研究畢赤酵母的糖基化、磷酸化等修飾機(jī)制與甜度的關(guān)系，通過基因工程或發(fā)酵條件優(yōu)化，調(diào)整修飾模式和程度，使甜蛋白的修飾更接近天然狀態(tài)，提升甜度。

結(jié)論

甜味蛋白作為非糖甜味劑，其甜度是等濃度蔗糖的千倍以上，同時(shí)熱量低、甜味持續(xù)時(shí)間長且可被降解為氨基酸以供人體吸收利用，因此具有廣闊的發(fā)展前景。本研究成功構(gòu)建了畢赤酵母重組工程菌

K. phaffii Bra

-1，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)地發(fā)酵過程單因素優(yōu)化。證實(shí)2.0%的甲醇、0.08%的初始生物素、30 ℃的培養(yǎng)溫度和6.0的初始pH值能夠顯著提高搖瓶條件下Brazzein的表達(dá)量。進(jìn)一步的研究中，通過替換和改造啟動(dòng)子及信號肽，確定了啟動(dòng)子P AOX1 和信號肽S αΔ57-70 為最優(yōu)選擇，進(jìn)一步共表達(dá)分子伴侶PDI后獲得了顯著提高Brazzein表達(dá)量的畢赤酵母重組工程菌

K. phaffii Bra

-18。擴(kuò)大生物反應(yīng)器規(guī)模至5 L，通過優(yōu)化發(fā)酵起始生物量和誘導(dǎo)期pH值后獲得1.4 g/L的蛋白表達(dá)量，并探索了BSM工業(yè)化培養(yǎng)基在甜味蛋白表達(dá)中的潛力，最終可以獲得1.2 g/L的產(chǎn)量，本研究為進(jìn)一步推動(dòng)甜味蛋白走向工業(yè)化生產(chǎn)提供了異源表達(dá)強(qiáng)化策略和優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵種質(zhì)資源。

本文《 畢赤酵母高效合成甜味蛋白Brazzein 》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第17期111-119 頁， 作者： 高 鵬，張勝夢，孫元偉，黃巍巍，邱益彬，徐 虹，張 琦，李 莎* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250311-087 。 點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：林安琪；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)