近日，浙江大學(xué)潘榮輝教授課題組聯(lián)合浙江大學(xué)沈星星教授課題組和中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心豐培強研究員課題組在The Plant Cell期刊發(fā)表了題為Structure-guided Discovery of Protein Functions in Plants的研究論文。該研究利用人工智能預(yù)測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，對17種代表性被子植物的56萬余個蛋白進行了系統(tǒng)性結(jié)構(gòu)聚類與功能注釋，發(fā)現(xiàn)了120個在植物中廣泛保守但此前無法通過傳統(tǒng)序列方法注釋功能的蛋白家族。研究團隊進一步聚焦其中一個結(jié)構(gòu)上與酵母過氧化物酶體蛋白PEX8高度相似的植物蛋白，通過實驗驗證了植物PEX8-like蛋白確實具有與酵母PEX8等價的功能，建立了從蛋白三維結(jié)構(gòu)出發(fā)、跨越序列差異發(fā)現(xiàn)基因功能的研究新策略。

解析植物蛋白的功能對于基礎(chǔ)生物學(xué)研究和作物改良至關(guān)重要。然而，即便在模式植物擬南芥中，至今仍有約26%的蛋白功能未知。傳統(tǒng)的基于序列相似性的同源搜索方法，是蛋白功能注釋中長期依賴的核心手段；但當(dāng)?shù)鞍自诼L演化過程中序列發(fā)生劇烈分化、相似性顯著下降時，序列方法往往無法識別遠緣同源關(guān)系，導(dǎo)致大量蛋白長期處于功能未知的”暗物質(zhì)”狀態(tài)。

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)在演化過程中通常比其氨基酸序列更加保守，且與分子功能更為直接相關(guān)。隨著AlphaFold等AI蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測技術(shù)的突破性發(fā)展，從蛋白結(jié)構(gòu)層面系統(tǒng)探索這些”暗物質(zhì)”基因的功能，成為一種極具潛力的新策略。

被子植物蛋白結(jié)構(gòu)圖譜的構(gòu)建

研究團隊選取了17種代表性被子植物，涵蓋2種基部被子植物、6種單子葉植物和9種雙子葉植物，從AlphaFold數(shù)據(jù)庫中獲取了共564,657個蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。利用FoldSeek算法對這些蛋白進行結(jié)構(gòu)聚類，共獲得177,510個結(jié)構(gòu)簇，其中25,825個包含兩個及以上成員的非單一簇。質(zhì)量評估顯示，這些簇內(nèi)部結(jié)構(gòu)一致性高，中位LDDT和TM分?jǐn)?shù)分別為0.84和0.74，67.6%的簇展現(xiàn)出100%的Pfam結(jié)構(gòu)域一致性（圖1A-D）。

圖1被子植物蛋白結(jié)構(gòu)聚類流程及質(zhì)量評估。(A) 本研究選取的17種被子植物的分析。系統(tǒng)發(fā)育樹后的三組柱狀圖分別展示了蛋白質(zhì)組完整性的BUSCO評估結(jié)果、蛋白質(zhì)組中可用蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)量，以及結(jié)構(gòu)預(yù)測置信度分?jǐn)?shù)（pLDDT）的分布。(B) 被子植物蛋白結(jié)構(gòu)的聚類流程示意。去除單一成員簇后，保留了25,825個包含至少兩個成員的簇。(C) 564,657個蛋白結(jié)構(gòu)中預(yù)測置信度分?jǐn)?shù)（pLDDT）的累積分布。(D) 25,825個非單一簇純度的分布，分別以Pfam一致性、模板建模分?jǐn)?shù)（TM-score）和局部距離差異檢驗（LDDT）進行量化。

結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的功能注釋：發(fā)現(xiàn)120個”暗物質(zhì)”蛋白家族

研究團隊建立了一套嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)功能注釋流程：首先將每個結(jié)構(gòu)簇的代表蛋白與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫（經(jīng)專家手動審核的高質(zhì)量蛋白注釋庫）進行結(jié)構(gòu)比對和序列比對；然后篩選出那些僅能通過結(jié)構(gòu)比對獲得功能信息、而無法被傳統(tǒng)BLAST序列搜索識別的蛋白簇（圖2A）。

經(jīng)過逐層嚴(yán)格過濾——結(jié)構(gòu)質(zhì)量（pLDDT≥0.7，TM≥0.5）、物種覆蓋度（≥10個物種）、以及與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫（UniProtKB、TAIR、EggNOG-mapper、HHblits）的交叉驗證——最終鑒定出120個在被子植物中廣泛保守、此前功能完全未知的蛋白家族（圖2B-D）。

這些蛋白并非在生物學(xué)上無足輕重。它們的功能涵蓋蛋白結(jié)合、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)運體活性等多個關(guān)鍵類別。值得注意的是，它們的結(jié)構(gòu)匹配來源廣泛，涵蓋動物、真菌、細(xì)菌等多個類群，其中不少來自酵母、人類等非植物模式生物，表明蛋白結(jié)構(gòu)相似性能夠跨越巨大的系統(tǒng)發(fā)育距離，連接不同類群間保守的分子功能（圖2E-F）。

圖2(A) 25,825個非單一簇的比對流程。(B) 3,109個結(jié)構(gòu)比對結(jié)果無法被序列BLAST識別的簇的分布。篩選出的簇（橙色）滿足以下條件：（1）TM-score≥0.5，表明具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性；（2）pLDDT分?jǐn)?shù)≥0.7，確保結(jié)構(gòu)預(yù)測具有高置信度。(C) 1,292個篩選簇中每簇包含的物種數(shù)量。(D) 與多個參考數(shù)據(jù)庫進行人工交叉驗證，以排除功能注釋與其結(jié)構(gòu)匹配至少部分重疊的代表蛋白/簇。(E) 120個保守簇在不同物種類型中的最佳匹配分布，以及蛋白的預(yù)測亞細(xì)胞定位。(F) 120個被子植物簇中分子功能計數(shù)前10的GO術(shù)語。

跨界發(fā)現(xiàn)新蛋白功能

研究揭示了多個蛋白功能發(fā)現(xiàn)案例：

1. 植物體內(nèi)可能存在酵母型RNA三磷酸酶。Cluster_12521與裂殖酵母的PCT1（RNA 5′三磷酸酶）結(jié)構(gòu)高度相似。此前，植物中僅發(fā)現(xiàn)了哺乳動物型的mRNA加帽酶（ARCP1/ARCP2），而酵母型三磷酸酶從未在植物中被鑒定。這一發(fā)現(xiàn)提示被子植物可能同時擁有兩種類型的RNA三磷酸酶。（圖3A）

2. 葉綠體包膜上可能存在來自內(nèi)共生祖先的孔蛋白。Cluster_12986與細(xì)菌外膜孔蛋白Omp32/OmpC結(jié)構(gòu)匹配，其擬南芥成員已被實驗證實定位于葉綠體包膜。進一步分析顯示該蛋白與藍藻同源物的相似性高于大腸桿菌，暗示其可能隨葉綠體的內(nèi)共生起源而被保留。（圖3B）

3. 種子植物中廣泛存在的液泡蛋白VAC8同源物。Cluster_21741與酵母液泡蛋白VAC8結(jié)構(gòu)相似，后者參與液泡遺傳和蛋白靶向。有趣的是，VAC8-like蛋白在綠藻中完全缺失，在苔蘚中零星出現(xiàn)，在種子植物中大量擴增，卻在核心十字花目（包括擬南芥所在的十字花科）中特異丟失。（圖3C）

圖3(A) Cluster_12521與粟酒裂殖酵母（S. pombe）的RNA三磷酸酶結(jié)構(gòu)匹配。(B) Cluster_12986與食酸代爾夫特菌（D. acidovorans）的OmpC結(jié)構(gòu)匹配。(C) Cluster_21741與與酵母（S. pombe）液泡蛋白8（VAC8）結(jié)構(gòu)匹配。圖中紅色和藍色數(shù)字分別表示TM-score和序列相似度。

植物中”缺失”的過氧化物酶體蛋白PEX8

在120個蛋白家族中，研究團隊重點關(guān)注了Cluster_10847——一個與酵母過氧化物酶體蛋白PEX8結(jié)構(gòu)高度相似的植物蛋白家族。PEX8是酵母中已知的過氧化物酶體生物發(fā)生關(guān)鍵因子，但此前從未在植物中被識別，因為植物與酵母的PEX8蛋白在序列層面差異極大（圖4A）。

研究團隊通過系統(tǒng)的實驗驗證，證實了植物PEX8-like蛋白確為PEX8的功能等價物：

亞細(xì)胞定位：來自擬南芥、水稻和苔蘚的PEX8-like蛋白均定位于過氧化物酶體。

遺傳學(xué)分析：擬南芥pex8突變體表現(xiàn)為純合致死，胚胎發(fā)育停滯在心形期，與已知的其他過氧化物酶體蛋白突變體表型一致。

酵母互補實驗：來自擬南芥、水稻和苔蘚的PEX8基因均能成功互補畢赤酵母pex8突變體的生長缺陷，提供了植物PEX8確實具有PEX8功能的直接證據(jù)（圖4B）。

靶向機制保守：與酵母PEX8一致，植物PEX8不依賴PTS1信號肽即可靶向過氧化物酶體，暗示它們來自同一祖先基因。

圖4(A) 來自Cluster_10847的擬南芥PEX8-like蛋白與來自4種不同酵母（畢赤酵母Pichia pastoris、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、多形漢遜酵母Hansenula polymorpha和解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica）的PEX8蛋白的結(jié)構(gòu)比較。(B) 擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和小立碗蘚（Physcomitrella patens）中PEX8的蛋白結(jié)構(gòu)以及野生型和突變體（以擬南芥、水稻、小立碗蘚PEX8基因回補）畢赤酵母菌株的生長分析。

綜上所述，該研究首次在植物中系統(tǒng)開展了基于蛋白結(jié)構(gòu)的功能注釋，建立了面向植物蛋白功能發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究范式。研究不僅揭示了120個此前功能未知的保守蛋白家族，更以PEX8為例，實驗證實了結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白即便序列大幅分化，仍可保持等價的生物學(xué)功能。這些發(fā)現(xiàn)為植物蛋白功能的系統(tǒng)解析提供了重要資源，也為作物改良等應(yīng)用研究提供了新的潛在分子靶點。

為方便研究者查詢和使用這些數(shù)據(jù)，研究團隊同步發(fā)布了在線數(shù)據(jù)庫（https://ai-biolab.cn），支持基于基因ID的數(shù)據(jù)檢索。

The Plant Cell

評述文章特別強調(diào)了本研究的核心發(fā)現(xiàn)：通過對17種被子植物超過55萬個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)聚類分析，研究團隊鑒定出120個在植物中廣泛保守、但傳統(tǒng)序列方法無法注釋功能的蛋白家族。其中約87個家族與動物、真菌、原生生物和細(xì)菌的蛋白具有結(jié)構(gòu)同源性，另有約33個家族為植物所特有。評述還著重介紹了植物PEX8蛋白的發(fā)現(xiàn)——這一此前被認(rèn)為在植物中不存在的過氧化物酶體關(guān)鍵蛋白，盡管與酵母PEX8在序列上高度分化，卻共享獨特的靶向機制，指向共同的祖先起源。評述認(rèn)為，這一結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的蛋白功能發(fā)現(xiàn)策略代表了一種創(chuàng)新而強大的研究范式，有望為解答廣泛的植物研究問題開辟新途徑，推動植物生物學(xué)認(rèn)知的深入發(fā)展。

浙江大學(xué)博士生陳佳榮、副研究員馮彥磊（杭州國際科創(chuàng)中心）、博士生張鈺嬋（已畢業(yè)）和博士后高炬燦（現(xiàn)為浙江工業(yè)大學(xué)副研究員）為共同第一作者。浙江大學(xué)潘榮輝教授、浙江大學(xué)沈星星教授和中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心豐培強研究員為共同通訊作者。該研究受到了國家自然科學(xué)基金、浙江省自然科學(xué)基金等經(jīng)費資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/plcell/koag022