近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的突破為植物與病原物互作研究帶來了前所未有的精度提升：前者能夠在單個(gè)細(xì)胞水平上解析基因表達(dá)，揭示植物應(yīng)答病原侵染時(shí)的細(xì)胞異質(zhì)性；后者則能夠繪制基因在組織內(nèi)的空間表達(dá)圖譜，追蹤特定位置和時(shí)間下的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)。兩者的整合為解析植物免疫的分子機(jī)制提供了全新視角，直觀地揭示了不同細(xì)胞類型和組織區(qū)域如何協(xié)同應(yīng)對(duì)外界脅迫。由多堆柄銹菌（Puccinia polysora, P. p）侵染引起的玉米南方銹病，是威脅全球玉米生產(chǎn)的重要病害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)50%以上。病原菌通過玉米葉片表面侵入，在植株系統(tǒng)性擴(kuò)展，破壞光合作用，影響籽粒灌漿。盡管已有多個(gè)南方銹病基因被鑒定，但玉米如何在不同細(xì)胞類型和組織層面協(xié)調(diào)免疫響應(yīng)，一直是尚未解析的關(guān)鍵問題。

近日，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所曹言勇團(tuán)隊(duì)聯(lián)合河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院施艷團(tuán)隊(duì)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所段燦星團(tuán)隊(duì)在Advanced Science期刊在線發(fā)表題為“Integrated Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveal Cell-Type- Specific Immune Regulatory Networks in Maize Responding to Southern Corn Rust”的研究論文， 該研究整合單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，構(gòu)建了玉米應(yīng)答南方銹病侵染早期的高分辨率時(shí)空轉(zhuǎn)錄圖譜。首次系統(tǒng)描繪了8種主要葉片細(xì)胞類型在病原菌侵染過程中的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，揭示了表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞在早期免疫中的核心作用，并明確了不同細(xì)胞類型在免疫響應(yīng)中的功能分工。并挖掘出了ZmXET1和ZmRBG為玉米防御南方銹病的關(guān)鍵基因，為抗病育種提供了有價(jià)值的靶點(diǎn)。

1. P. p在玉米幼苗葉片中的侵染建立

通過系統(tǒng)的時(shí)間進(jìn)程分析，明確了P. p在抗病玉米自交系齊319葉片中的早期侵染動(dòng)態(tài)。接種后24小時(shí)，P. p已完成初始侵染并形成氣孔下囊，但葉片表面無可見癥狀；接種后48小時(shí)菌絲擴(kuò)展并形成吸器，接種后72小時(shí)侵染進(jìn)一步推進(jìn)但癥狀仍不顯現(xiàn)，直至10天后才出現(xiàn)典型病斑和孢子堆。結(jié)合組織學(xué)觀察與真菌生物量定量，研究將24和48小時(shí)確定為侵染早期的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)——此時(shí)真菌已建立侵染而寄主防御反應(yīng)尚未全面啟動(dòng)，為后續(xù)解析玉米對(duì)南方銹病的早期響應(yīng)機(jī)制提供了重要的時(shí)間窗口（圖1）。

圖1. 玉米葉片中P. p的侵染過程

2. P. p侵染玉米葉片的細(xì)胞類型鑒定

利用單核和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了P. p侵染24和48小時(shí)后玉米葉片的細(xì)胞類型圖譜。共獲得13萬余個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞核數(shù)據(jù)，經(jīng)聚類分析鑒定出16個(gè)細(xì)胞簇，歸并為8種主要細(xì)胞類型，包括葉肉細(xì)胞、表皮細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞等（圖2）。通過標(biāo)記基因篩選和GO富集分析，明確了各細(xì)胞類型的功能特征，如葉肉細(xì)胞主要參與光合作用和防御相關(guān)代謝。結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫和RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了關(guān)鍵標(biāo)記基因的特異性表達(dá)。該高分辨率單細(xì)胞圖譜為后續(xù)解析細(xì)胞類型特異性免疫響應(yīng)提供了可靠的基礎(chǔ)。

圖2. 受P. p侵染的玉米葉片細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

3. 基于空間轉(zhuǎn)錄組圖譜的P. p侵染玉米葉片組織可視化分析

進(jìn)一步利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)P. p侵染玉米葉片過程中基因表達(dá)的空間可視化解析。通過對(duì)接種后24和48小時(shí)的葉片切片進(jìn)行測(cè)序，共獲得21388個(gè)有效空間位點(diǎn)，聚類為7個(gè)細(xì)胞簇，并成功將其定位到葉片橫切面的具體解剖位置。結(jié)合標(biāo)記基因驗(yàn)證，明確了5種主要細(xì)胞類型：表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞、維管組織細(xì)胞和伴胞。進(jìn)一步鑒定出各細(xì)胞類型的特異性標(biāo)記基因。分析發(fā)現(xiàn)，侵染后24和48小時(shí)，表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞中細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)量顯著上升，提示這兩類細(xì)胞在玉米應(yīng)答病原菌侵染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖3）。

圖3 受P. p侵染的玉米葉片空間轉(zhuǎn)錄組圖譜

4. 免疫相關(guān)基因的細(xì)胞類型特異性差異表達(dá)

進(jìn)一步系統(tǒng)分析了玉米葉片中免疫相關(guān)基因的細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)，模式識(shí)別受體相關(guān)基因（RLPs和RLKs）在侵染后24小時(shí)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞類型差異：RLP基因（如Zm00001eb170180）主要在葉肉細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，而RLK基因則在表皮細(xì)胞和鋪板細(xì)胞中顯著激活?？共』蚍矫妫鄶?shù)NL類型基因在侵染后下調(diào)，部分CNL類型基因則表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。進(jìn)一步分析茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）信號(hào)通路相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，這兩條激素通路的響應(yīng)不具有明顯的細(xì)胞類型特異性，而是在各細(xì)胞類型中呈現(xiàn)較為一致的激活模式。值得注意的是，激素通路在侵染后24小時(shí)整體被激活，但部分基因（如ZmbHLH116）的表達(dá)則延遲至48小時(shí)才顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明， 玉米葉片應(yīng)答侵染時(shí)，免疫識(shí)別相關(guān)基因表現(xiàn)出精細(xì)的細(xì)胞類型分工，而激素信號(hào)通路則呈現(xiàn)時(shí)間動(dòng)態(tài)的協(xié)同調(diào)控特征（圖4）。

圖4 免疫相關(guān)基因的細(xì)胞類型特異性差異表達(dá)

5. 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析揭示玉米葉片響應(yīng)P. p侵染的核心功能模塊

通過共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，揭示了玉米葉片應(yīng)答P. p侵染過程中的空間協(xié)調(diào)防御模式。共鑒定出14個(gè)基因共表達(dá)模塊，其中3個(gè)模塊在侵染后24小時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性的顯著變化：維管束鞘細(xì)胞中“綠松石模塊”基因顯著上調(diào)，主要參與氧化脅迫響應(yīng)；葉肉細(xì)胞中“黃綠色模塊”被激活，富集于光合作用相關(guān)過程；而表皮細(xì)胞中“綠色模塊”基因顯著下調(diào)，主要涉及細(xì)胞壁生物合成。進(jìn)一步鑒定出各模塊的核心樞紐基因——維管束鞘中的半胱氨酸蛋白酶基因ZmCPP3、葉肉中的光捕獲蛋白基因ZmLHCB7以及表皮中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZmSTP19，它們?cè)谇秩驹缙诘谋磉_(dá)變化進(jìn)一步驗(yàn)證了上述模塊的調(diào)控方向。綜合這些結(jié)果， 研究提出一個(gè)“兩階段防御重編程”模型：1）侵染后24小時(shí)，玉米葉片內(nèi)部細(xì)胞（維管束鞘和葉肉）迅速激活脅迫響應(yīng)和光保護(hù)通路，2）同時(shí)表皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)合成暫時(shí)受到抑制。 這種空間上分工明確的調(diào)控策略，可能有助于植株在早期將資源集中于關(guān)鍵防御部位（圖5）。

圖5 共表達(dá)模塊揭示了與玉米葉片受P. p侵染相關(guān)的關(guān)鍵功能模塊

6. 分化軌跡與細(xì)胞注釋揭示防御型葉肉細(xì)胞的重要作用

通過擬時(shí)序分析，進(jìn)一步揭示了葉肉細(xì)胞在應(yīng)答P. p侵染過程中的功能分化。基于基因表達(dá)特征，葉肉細(xì)胞被劃分為光合型、前體型、傳遞型、海綿組織型和防御響應(yīng)型5個(gè)功能亞群。擬時(shí)序軌跡分析顯示，細(xì)胞分化路徑由海綿組織葉肉細(xì)胞起始，經(jīng)防御響應(yīng)型葉肉細(xì)胞，最終到達(dá)葉肉傳遞細(xì)胞。比較侵染組與對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，侵染后24小時(shí)，兩組細(xì)胞分化軌跡出現(xiàn)明顯分離，差異主要集中在海綿組織與防御響應(yīng)型細(xì)胞之間；同時(shí)，防御響應(yīng)型葉肉細(xì)胞的比例在24小時(shí)顯著上升，至48小時(shí)差異減弱。對(duì)該亞群的基因功能分析表明，其高表達(dá)基因主要參與脅迫應(yīng)答、脫落酸信號(hào)通路和活性氧響應(yīng)等過程。其中，細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)蛋白酶基因ZmCIP1在侵染后24小時(shí)的葉肉細(xì)胞中顯著上調(diào)，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一表達(dá)特征（圖6）。這些結(jié)果表明，防御響應(yīng)型葉肉細(xì)胞是玉米早期免疫的重要組成部分，在病原菌侵染后被迅速招募并執(zhí)行特定的防御任務(wù)。

圖6 葉肉細(xì)胞響應(yīng)P. p侵染的分化軌跡

7. 分化細(xì)胞間通訊揭示P. p從表皮細(xì)胞到葉肉細(xì)胞的侵染過程

通過細(xì)胞間通訊分析，揭示了玉米葉片應(yīng)答侵染過程中不同細(xì)胞類型之間的協(xié)同配合。分析表明，表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞之間存在廣泛的基因互作網(wǎng)絡(luò)（圖7）。聚焦于表皮與葉肉細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)配體-受體對(duì)在侵染后被激活。例如，表皮細(xì)胞中的熱休克蛋白基因ZmHSP90與葉肉細(xì)胞中的細(xì)胞壁相關(guān)激酶基因ZmWAK2存在特異性互作；另一個(gè)HSP90家族成員與葉肉細(xì)胞中一個(gè)未知功能基因的互作對(duì)，則僅在侵染后的玉米葉片中檢測(cè)到，表現(xiàn)出病原菌誘導(dǎo)的細(xì)胞類型特異性（圖7）。進(jìn)一步整合空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因ZmGST3與葉肉細(xì)胞中的Zm00001eb061210這一互作對(duì)，在單核和空間兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均被穩(wěn)定檢出，且兩個(gè)基因在侵染后24和48小時(shí)均保持高表達(dá)水平。這些結(jié)果從 分子互作層面證實(shí)，表皮細(xì)胞與葉肉細(xì)胞在病原菌侵染過程中存在活躍的“對(duì)話”，這種細(xì)胞間的協(xié)同響應(yīng)是玉米構(gòu)建有效免疫的重要環(huán)節(jié)（圖7）。

圖 7 細(xì)胞間通訊揭示從表皮細(xì)胞到葉肉細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過程

8. 玉米抵御P. p侵染關(guān)鍵基因的鑒定

通過整合單核和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，系統(tǒng)鑒定了玉米應(yīng)答侵染的關(guān)鍵調(diào)控基因。差異表達(dá)分析顯示，侵染后24小時(shí)是轉(zhuǎn)錄響應(yīng)最活躍的時(shí)期，葉肉細(xì)胞、表皮細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中大量基因表達(dá)發(fā)生變化，而保衛(wèi)細(xì)胞中差異基因數(shù)量較少；至48小時(shí)，各細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)普遍減弱（圖8）。功能富集分析表明，侵染早期各細(xì)胞類型普遍激活蛋白質(zhì)加工與穩(wěn)定相關(guān)通路，而后期主要富集茉莉酸信號(hào)和脂質(zhì)氧化等過程。進(jìn)一步聚焦于葉肉和表皮細(xì)胞，研究在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的差異表達(dá)基因中篩選出5個(gè)核心基因。其中，4個(gè)基因（ZmEUL、ZmRBG、ZmLOX4、Zm00001eb165310）在侵染后上調(diào)表達(dá)，而木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶基因ZmXET1則顯著下調(diào)（圖8）。單細(xì)胞和空間數(shù)據(jù)均驗(yàn)證了這些基因的表達(dá)變化趨勢(shì)。為驗(yàn)證這些基因的功能，研究采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對(duì)ZmXET1和ZmRBG進(jìn)行了表型分析。沉默ZmXET1后，植株接種病原菌后癥狀明顯減輕，真菌生物量減少，細(xì)胞損傷程度降低；而沉默ZmRBG則導(dǎo)致病害加重，真菌增殖更旺盛，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重。這兩個(gè)基因呈現(xiàn)相反的功能 方向：ZmXET1負(fù)向調(diào)控抗病性，ZmRBG則正向參與防御響應(yīng)。綜合以上結(jié)果，研究不僅從多組學(xué)數(shù)據(jù)中挖掘出核心候選基因，還通過功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它們?cè)谟衩椎钟^程中的作用，為后續(xù)抗病育種提供了重要靶點(diǎn)。

圖8 參與玉米抵御P. p侵染的關(guān)鍵基因

綜上，該研究首次構(gòu)建了玉米防御南方銹病的高分辨率時(shí)空轉(zhuǎn)錄圖譜，為理解玉米如何在不同細(xì)胞層面協(xié)調(diào)免疫響應(yīng)提供了基礎(chǔ)框架。不僅揭示了不同細(xì)胞類型在免疫中的“分工合作”，還成功鑒定并驗(yàn)證了兩個(gè)關(guān)鍵基因的功能。這一發(fā)現(xiàn)為玉米抗病育種提供了全新的分子靶點(diǎn)，也為未來精準(zhǔn)設(shè)計(jì)抗病作物奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/神農(nóng)種業(yè)實(shí)驗(yàn)室曹言勇研究員、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院糧食作物病蟲害檢測(cè)與防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)施艷教授和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所段燦星研究員為共同通訊作者。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院糧食作物病蟲害檢測(cè)與防控創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)青年教師王瓊瓊博士、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所在站博士后孫新艷副研究員、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)在站博士后孫迎超及河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所程澤強(qiáng)研究員為論文共同第一作者。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)湯繼華教授、李洪連教授，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所程子祥博士，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士研究生韓勝博，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生馮瑩，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院青年教師吳曉林副教授、張菁華副教授，以及團(tuán)隊(duì)楊文博博士、朱美琛博士等多名成員也參與了此項(xiàng)工作的研究。本研究得到河南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新興學(xué)科專項(xiàng)、北京聯(lián)創(chuàng)種業(yè)科企合作項(xiàng)目、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程、河南省高校創(chuàng)新科研團(tuán)隊(duì)、河南省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)青年人才托舉計(jì)劃項(xiàng)目及河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系等項(xiàng)目聯(lián)合資助。感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所翁建峰研究員、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)周濤教授為本項(xiàng)目提供的指導(dǎo)與幫助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202512295