在無法實現(xiàn)母乳喂養(yǎng)時，以牛乳蛋白為基礎(chǔ)的嬰幼兒配方奶粉（IMF）是滿足嬰幼兒營養(yǎng)需求的唯一替代品。然而牛乳蛋白和母乳蛋白在結(jié)構(gòu)上存在較大差異。母乳中主要的酪蛋白為β-酪蛋白（β-CN），其一級結(jié)構(gòu)以含有0～5 個磷酸基團(tuán)的較低磷酸化形式存在，有6 種磷酸化水平，而牛乳中β-CN以含5 個磷酸基團(tuán)的高度磷酸化形式存在。因此，對牛乳β-CN進(jìn)行脫磷酸修飾，脫除部分磷酸基團(tuán)，可使其一級結(jié)構(gòu)更類似母乳β-CN，進(jìn)一步縮小牛乳和母乳蛋白的差異。

有研究表明，母乳β-CN與牛乳β-CN的消化特性差異與蛋白磷酸化程度有關(guān)，并且有研究者發(fā)現(xiàn)，牛乳β-CN經(jīng)部分脫磷酸處理后更易消化，產(chǎn)生的肽種類更多，與母乳β-CN更相似。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系的宋思家、林瑩瑩、郭慧媛*等對牛乳β-CN進(jìn)行酶法脫磷酸化修飾，制備部分脫磷酸β-CN（PDP-BCN），并對其進(jìn)行體外模擬嬰兒胃腸消化，對消化產(chǎn)物的肽譜特征和活性肽進(jìn)行全面表征，以期為PDP-BCN未來作為一種新型蛋白配料在IMF中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

01

PDP-BCN的Urea-PAGE分析

天然狀態(tài)的牛乳β-CN以含有5 個磷酸基團(tuán)的高度磷酸化形式存在，而母乳β-CN是以含0～5 個磷酸基團(tuán)的低磷酸化形式存在。經(jīng)酶促脫磷酸處理后，牛乳β-CN可以脫除部分磷酸基團(tuán)，使其結(jié)構(gòu)更接近母乳。如圖3所示，條帶1為β-CN，由于其磷酸化程度單一，所以僅有1 個條帶；條帶2為PDP-BCN，具有數(shù)個條帶，且都位于天然β-CN條帶的上方，分別對應(yīng)著不同脫磷酸化程度的β-CN，表明在本實驗條件下成功制得了PDP-BCN。Urea-PAGE能夠根據(jù)蛋白質(zhì)凈荷質(zhì)比區(qū)分β-CN和PDP-BCN。由于PDP-BCN經(jīng)酶促反應(yīng)去除部分磷酸基團(tuán)，使其凈電荷大大降低，而分子質(zhì)量的變化可忽略不計，因此其荷質(zhì)比明顯降低，導(dǎo)致β-CN的電泳遷移率隨脫磷酸程度的升高而降低。

02

PDP-BCN在模擬嬰幼兒胃液中的絮凝結(jié)構(gòu)及粒徑分布

采用CLSM觀察β-CN和PDP-BCN在模擬嬰幼兒胃液中消化0、30、60 min后的絮凝結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖4所示。在剛開始消化時，天然β-CN溶液與模擬嬰幼兒胃液接觸后形成了較大的絮凝結(jié)構(gòu)，隨消化時間的延長，凝塊逐漸減小，但胃消化60 min時，仍有一部分較大的凝塊存在；PDP-BCN溶液在剛與模擬嬰幼兒胃液混合時，形成的絮凝結(jié)構(gòu)相較于天然β-CN更小，隨消化時間的延長，凝塊越來越小，在胃消化60 min時幾乎無較大的凝塊存在，表明在模擬嬰幼兒胃液中PDP-BCN比β-CN更易消化。PDP-BCN是β-CN脫除部分磷酸基團(tuán)的結(jié)果，因此其等電點會高于天然β-CN，使其在模擬嬰幼兒胃液（pH 4.0）中攜帶的正電荷大于天然β-CN，蛋白分子間的靜電斥力更大，更不容易相互聚集，因而形成的絮凝結(jié)構(gòu)更小。

如圖5、表1所示，隨消化時間的延長，β-CN和PDP-BCN的粒徑分布均向小粒徑方向遷移，同時2 組蛋白的平均粒徑也隨之減小，在消化起始及消化30、60 min后，β-CN和PDP-BCN的平均粒徑分別為88.90、48.02、35.06 μm和23.42、19.80、18.82 μm，表明β-CN和PDP-BCN凝塊逐漸被消化成更小的顆粒。與β-CN相比，在每個消 化時間點的PDP-BCN平均粒徑均顯著降低（P＜0.05），表明PDP-BCN比β-CN在SGF中形成的絮凝結(jié)構(gòu)更小且消化得更快，與上述CLSM的觀察結(jié)果相印證，也與Liu Dasong和Yang Tingting等的報道一致。

03

PDP-BCN經(jīng)模擬胃腸消化后產(chǎn)生肽的組成及特征

采用LC-MS/MS技術(shù)對β-CN和PDP-BCN在模擬嬰幼兒胃腸消化過程中降解產(chǎn)生的肽進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)β-CN和PDP-BCN在消化結(jié)束后降解產(chǎn)生952 個肽段，對整體肽段的組成和特征進(jìn)行分類分析：通過主成分分析（PCA）對樣品間肽段的差異進(jìn)行降維可視化；采用Venn圖和柱狀圖對樣品間肽段種類和豐度的差異進(jìn)行表征；基于Peptigram軟件對β-CN和PDP-BCN降解肽進(jìn)行肽指紋圖譜分析；進(jìn)一步將樣品中鑒定到的所有肽段與MBPDB[中的活性肽進(jìn)行比對，以揭示β-CN和PDP-BCN降解產(chǎn)生活性肽的差異。

PCA能將原始數(shù)據(jù)壓縮成多個PC描述原始數(shù)據(jù)集的特征，PC1表示能描述數(shù)據(jù)最明顯的特征，PC2表示除PC1之外所能描述數(shù)據(jù)最顯著的特征。如圖6所示，PC1和PC2對樣品差異的方差貢獻(xiàn)率分別為80.37%和18.47%，共計98.84%，可以代表絕大部分變量信息。每種蛋白的4 個平行樣本對應(yīng)得分點重疊或者距離極近，說明樣品的重復(fù)性良好。β-CN的得分點集中在圖的右下側(cè)，PDP-BCN位于左上側(cè)，2 種蛋白間的得分點相聚較遠(yuǎn)，表明它們的肽段組成之間存在顯著差異。

Venn圖能夠?qū)ⅵ?CN和PDP-BCN肽段種類的重合情況和差異數(shù)量直觀地展示出來。如圖7所示，β-CN和PDPBCN降解產(chǎn)生的肽段分別為533 種和880 種，其中在2 組樣品中均檢測到的肽段有461 種，僅在β-CN樣品中檢測到的特異性肽段有72 種，僅在PDP-BCN樣品中檢測到的特異性肽段有419 種。結(jié)果表明PDP-BCN在模擬嬰幼兒胃腸消化過程中產(chǎn)生肽段的種類多于β-CN，可能是由于脫除部分磷酸基團(tuán)后，PDP-BCN結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的變化，使得蛋白中更多的酶切位點暴露，因此產(chǎn)生了更多的特異性肽段。

圖8展示了β-CN及PDP-BCN經(jīng)體外模擬嬰幼兒胃腸消化后降解產(chǎn)生的不同長度肽段的差異。在≤10、11～20、21～30和＞30每個區(qū)間內(nèi)，PDP-BCN降解產(chǎn)生的肽段分別為172、458、198 種和52 種，β-CN降解產(chǎn)生的肽段分別為135、286、77 種和35 種，PDP-BCN產(chǎn)生的肽段種類均明顯多于β-CN，表明PDP-BCN降解更充分。PDP-BCN和β-CN豐度最高的肽段區(qū)間均為11～20 個肽段，表明這2 種蛋白降解產(chǎn)生的主要肽段長度均為11～20，這與李星及Liu Dasong等的研究結(jié)果一致。

肽指紋圖譜是指蛋白降解產(chǎn)生的肽段序列與原蛋白的氨基酸序列進(jìn)行匹配，進(jìn)而將肽段的種類、裂解位點及豐度全局性地展示出來。圖9展示了PDP-BCN和β-CN的肽指紋圖譜，每個樣品單獨一行。無論是肽段的種類還是豐度，PDP-BCN均高于β-CN，特別是在蛋白N端位置，這種差異尤為顯著。這是因為β-CN的5 個磷酸基團(tuán)均位于N端區(qū)域，對蛋白進(jìn)行脫磷酸處理后，該位置的結(jié)構(gòu)變化最大，空間位阻和靜電斥力明顯降低，使得此區(qū)域更多的酶切位點暴露，因此有機(jī)會產(chǎn)生更多的肽段。

肽比對圖能夠?qū)Φ鞍捉到猱a(chǎn)生的肽段序列進(jìn)一步詳細(xì)表征，可以將肽段的序列、裂解位點及豐度信息直觀詳細(xì)地展示出來。每個肽段序列都由綠色的框線包圍，放置在前體蛋白的對應(yīng)位點。重疊及相鄰的肽段垂直排列，以免不同肽段之間混淆不易區(qū)分。與肽指紋圖譜相似，每個肽框的綠色深淺與該位置肽段的豐度呈正比，即顏色越深，表明該肽段的豐度越高。由圖9可知，PDP-BCN和β-CN消化產(chǎn)生肽段的差異主要集中在N端前10～60 個氨基酸的位置，因此圖10詳細(xì)展示了在此區(qū)域上述2 種蛋白產(chǎn)生的肽段差異情況。PDP-BCN產(chǎn)生的肽段數(shù)量遠(yuǎn)高于β-CN，此外，PDP-BCN具有6 個深綠色肽段即高強(qiáng)度肽段，而β-CN沒有高強(qiáng)度肽段，表明在豐度上PDP-BCN也遠(yuǎn)大于β-CN。上述結(jié)果提示相對于β-CN，PDP-BCN在消化之后產(chǎn)生活性肽的潛力更高。

將β-CN和PDP-BCN樣品中鑒定出的所有差異肽段與MBPDB中的活性肽進(jìn)行比對，以分析2 種樣品降解產(chǎn)生活性肽的差異，結(jié)果如表2所示。僅在PDPBCN樣品中存在、未在β-CN樣品中檢測到的活性肽有8 種，涉及促進(jìn)鈣吸收、抗菌、抗炎、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制、抗氧化以及抑制膽固醇溶解等活性。其中EAMAPK、LNVPGEIVE、RDMPIQAF和VLPVPQ這4 條肽段的強(qiáng)度最高，且研究表明EAMAPK對革蘭氏陽性菌的最小抑菌濃度相對較低（≤25 μg/mL），提示其可能具有生理意義。LNVPGEIVE、RDMPIQAF和VLPVPQ發(fā)揮活性所需的半最大效應(yīng)濃度相對較高，分別為290、209、100 μg/mL，提示其發(fā)揮生理作用需要較高的劑量。此外已有研究證實，EAMAPK可抵抗刷狀緣肽酶水解并被Caco-2單層細(xì)胞吸收；富含LNVPGEIVE的酸奶可降低高血壓大鼠的血壓；VLPVPQ可被成年小鼠有效吸收并改善其脂質(zhì)代謝紊亂。雖然上述活性肽已被證實可抵抗消化并進(jìn)入細(xì)胞或體內(nèi)發(fā)揮作用，但在復(fù)雜的消化產(chǎn)物混合物中，其實際功能可能受到其他組分的干擾，因此是否能在真實環(huán)境中發(fā)揮功能仍需后續(xù)實驗驗證。

以80%同源性檢索數(shù)據(jù)庫中的活性肽段（基于相似物理性質(zhì)，選擇特定的氨基酸被等同替代，如纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；精氨酸和賴氨酸）。結(jié)果顯示，β-CN和PDP-BCN樣品的差異肽段中，僅在PDP-BCN樣品中存在、未出現(xiàn)在β-CN樣品中有活性肽潛力的肽段有137 種，其中有61 種具有潛在的促進(jìn)鈣吸收活性，有26 種具有潛在的抗菌活性，有10 種具有潛在的抗感染活性，有41 種具有潛在的ACE抑制活性；而僅在β-CN樣品中存在、未出現(xiàn)在PDP-BCN樣品中有活性肽潛力的肽段僅有31 種，其中沒有促進(jìn)鈣吸收活性的潛力肽段，具有潛在的抗菌活性肽段10 種，具有潛在的抗感染活性肽段8 種，具有潛在的ACE抑制活性肽段22 種。結(jié)果表明，相比于β-CN，PDP-BCN樣品在體外模擬消化過程中產(chǎn)生的活性肽種類更多，所涉及的活性范圍更廣，具有活性肽潛力的肽段更多。本研究聚焦于活性肽的鑒定和潛在活性肽的發(fā)掘，但未能直接驗證其在實際嬰幼兒胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性、吸收性及復(fù)雜混合物背景下的生物活性。這些關(guān)鍵問題需通過后續(xù)實驗，如體外模擬腸道吸收模型、類器官模型或動物實驗進(jìn)一步探討。

04

結(jié) 論

本研究對牛乳β-CN進(jìn)行酶法脫磷酸化修飾，制備PDP-BCN，并采用動態(tài)光散射、CLSM觀察和LC-MS/MS技術(shù)對其體外模擬胃腸消化特性和肽譜進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，PDP-BCN在模擬嬰幼兒胃液中形成的絮凝結(jié)構(gòu)及粒徑顯著小于天然β-CN，更易消化成小顆粒；而且其在模擬嬰幼兒胃腸消化過程中降解產(chǎn)生肽段的種類和豐度均遠(yuǎn)高于天然β-CN，特別是在蛋白N端位置的差異尤為顯著。此外，PDP-BCN產(chǎn)生活性肽的種類更多、涉及的活性范圍更廣，產(chǎn)生具有活性肽潛力的肽段更多。因此，在消化特性方面，PDP-BCN相較于天然β-CN具有明顯優(yōu)勢，在未來有很大的潛力成為一種新型IMF蛋白配料。

作者簡介

通信作者：

郭慧媛 教授

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系（校直屬） 副主任

郭慧媛，女，教授，博士生導(dǎo)師。入選教育部重大人才工程特聘教授、北京市卓越青年科學(xué)家；獲中國農(nóng)學(xué)會青年科技獎、中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會杰出青年獎。圍繞精準(zhǔn)營養(yǎng)與功能乳制品創(chuàng)制開展研究，擔(dān)任教育部功能乳品重點實驗室副主任、國家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心營養(yǎng)健康科學(xué)家；主持國家重點研發(fā)計劃項目1 項，國家自然科學(xué)基金項目4 項；在食品科學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊發(fā)表多篇文章，獲國家科技進(jìn)步獎二等獎3 項，獲得授權(quán)發(fā)明專利20 項。

引文格式：

宋思家, 林瑩瑩, 張雨凝, 等. 部分脫磷酸β-酪蛋白的體外消化特性[J]. 食品科學(xué), 2026, 47(2): 40-47. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250710-084.

SONG Sijia, LIN Yingying, ZHANG Yuning, et al. In vitro digestion characteristics of partially dephosphorylated bovine β-casein[J]. Food Science, 2026, 47(2): 40-47. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250710-084.

實習(xí)編輯：梁雯菁；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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