大黃魚（Larimichthys crocea），屬鱸形目（Perciformes）、石首魚科（Sciaenidae）、黃魚屬（Larimichthys），主要分布于東海、黃海南部以及南海，是中國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。大黃魚捕獲后主要以冰鮮或冷凍銷售為主，因其體內(nèi)內(nèi)源性蛋白酶活性高，在貯藏、運(yùn)輸及銷售過程中魚肉蛋白極易發(fā)生降解，造成品質(zhì)下降。其中，肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶（MBSP）是導(dǎo)致肌肉蛋白降解的主要內(nèi)源酶。

肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑（MBSPI）是MBSP的一種內(nèi)源性抑制劑，該抑制劑最早在白姑魚（Argyrosomus argentatus）中發(fā)現(xiàn)，并在其肌肉水溶性蛋白組分中得到分離純化。研究發(fā)現(xiàn)，MBSPI蛋白表面的“觸角”區(qū)域能夠與MBSP特異性結(jié)合，改變MBSP空間構(gòu)象，進(jìn)而抑制蛋白酶活性。

集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院的霍衛(wèi)森、張凌晶、曹敏杰*等以大黃魚為原料，從其背部肌肉中部分純化MBSP，并以該酶為靶標(biāo)酶，分離純化內(nèi)源性抑制劑MBSPI并測定其對MBSP的抑制作用，分析MBSPI對肌原纖維蛋白自身降解的抑制效果，旨在為回收利用水溶性蛋白及開發(fā)一種新型的魚糜凝膠增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 MBSPI的分離純化

為獲得高純度MBSPI，將MBSPI粗蛋白液上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換柱，結(jié)果如圖1A所示，收集抑制活性較高的未吸附組分進(jìn)行熱變性。將處理后的蛋白上樣于SP-Sepharose陽離子交換柱，去除未吸附雜蛋白后，吸附蛋白采用不同鹽濃度緩沖液梯度洗脫，目的蛋白在0.4 mol/L NaCl溶液中得到洗脫（圖1B）。對洗脫峰樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖1C所示，MBSPI顯示單一條帶，分子質(zhì)量為55 kDa。使用大鼠抗白姑魚MBSPI多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，在還原和非還原狀態(tài)下MBSPI在55 kDa處均為單一條帶（圖1D）。該結(jié)果與從白姑魚（55 kDa）、狗母魚（50 kDa）和藍(lán)圓鰺（55 kDa）中純化得到的MBSPI相似，但與從鯽魚（55、66、250 kDa）、白鰱魚（55、65、220 kDa）肌肉中純化得到的MBSPI不同。

2 MBSPI的質(zhì)譜鑒定

對MBSPI進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，將酶切后的肽段與大黃魚蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2所示，共有380 個肽段與大黃魚蛋白數(shù)據(jù)庫中的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（GPI）（Protein ID：A0A6G0J0R2）高度匹配，表明大黃魚MBSPI與GPI具有較高同源性。GPI是一種多功能蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)主要充當(dāng)催化酶角色，參與糖酵解過程中糖異生和戊糖磷酸途徑，催化葡萄糖-6-磷酸生成果糖-6-磷酸；在細(xì)胞外主要以細(xì)胞因子（如神經(jīng)白細(xì)胞素、自分泌運(yùn)動因子和成熟因子等）發(fā)揮活性功能。本研究發(fā)現(xiàn)大黃魚GPI可以作為抑制劑發(fā)揮調(diào)控MBSP活性的作用，該結(jié)果與Cao Minjie等從白姑魚（Argyrosomus argentatus）肌肉中純化得到的MBSPI相似。

3 MBSPI的二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)為多肽鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)，常見的二級結(jié)構(gòu)主要包含了α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲等。采用圓二色光譜對MBSPI的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3A所示。20 ℃（N-20 ℃）條件下MBSPI在210 nm和220 nm出現(xiàn)兩個負(fù)峰，分別代表α-螺旋的n→π*和π→π*電子躍遷。隨著溫度升高，絕對峰強(qiáng)度逐漸減弱，負(fù)峰值上移，表明蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸減少。當(dāng)溫度升至90 ℃峰強(qiáng)度降至最低，隨后降溫至20 ℃（TR-20 ℃）峰強(qiáng)度無法恢復(fù)，表明溫度導(dǎo)致的MBSPI變性是不可逆的。對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，低于50 ℃時，MBSPI二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，占總含量的49%，其次為無規(guī)卷曲（28%），反平行β-折疊最少，為2%（圖3B）。當(dāng)溫度上升至60 ℃時，α-螺旋相對含量降至25%，無規(guī)卷曲相對含量增加至38%，反平行β-折疊相對含量增加至11%；當(dāng)溫度上升至90 ℃時，α-螺旋相對含量降至16%，無規(guī)卷曲含量不變，反平行β-折疊含量繼續(xù)增加至22%。高溫可導(dǎo)致α-螺旋鏈內(nèi)氫鍵斷裂，熵增催動其折疊解離轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲。反平行β-折疊較平行β-折疊具有更優(yōu)的氫鍵排布，隨著溫度繼續(xù)升高，蛋白中暴露的疏水殘基促進(jìn)肽鏈間相互作用更偏向于形成反平行β-折疊。Tm是指蛋白構(gòu)象變化一半時對應(yīng)的溫度，Tm越高代表蛋白的熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。由圓二色光譜曲線擬合可知，MBSPI的Tm為（53.3±0.1）℃（圖3C）。

對MBSPI進(jìn)行全波長掃描，在激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長300～500 nm條件下出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光峰（圖3D）。蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸殘基如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸受到280 nm或295 nm的激發(fā)光會產(chǎn)生熒光，此熒光特性對微環(huán)境的改變較為敏感，當(dāng)微環(huán)境發(fā)生變化時，熒光強(qiáng)度會隨之改變，從而反映出蛋白質(zhì)的構(gòu)象和三級結(jié)構(gòu)變化。在最適激發(fā)和發(fā)射波長條件下測定MBSPI在20～60 ℃的三級結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖3E所示，MBSPI在350 nm波長處出現(xiàn)熒光峰；當(dāng)溫度低于40 ℃時，峰強(qiáng)度無明顯變化；隨著溫度上升峰強(qiáng)度顯著下降，當(dāng)溫度高于55 ℃時，熒光峰強(qiáng)度不再變化。320～350 nm區(qū)間的內(nèi)源性熒光峰主要由蛋白質(zhì)中色氨酸側(cè)鏈生色團(tuán)產(chǎn)生，熱處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子展開，從而使色氨酸從原本的疏水微環(huán)境暴露至親水環(huán)境中，導(dǎo)致熒光猝滅。MBSPI的變性溫度為53 ℃，高于此溫度，蛋白三級結(jié)構(gòu)被破壞，熒光強(qiáng)度不再變化。

4 不同條件下MBSPI對MBSP的抑制作用分析

將MBSPI在不同溫度、pH值條件下孵育后對MBSP進(jìn)行抑制分析。如圖4A所示，當(dāng)加熱溫度低于40 ℃時，MBSPI對MBSP的相對抑制活性超過60%；當(dāng)溫度升至50 ℃時，相對抑制活性保持在40%；隨著溫度繼續(xù)上升，相對抑制活性急速下降，至60 ℃時，相對抑制活性僅有10%；當(dāng)溫度超過熱變性溫度53 ℃時，MBSPI蛋白結(jié)構(gòu)被完全破壞，對MBSP不再具有抑制活性。在pH 8.0下，MBSPI對MBSP的相對抑制活性達(dá)到最高值（60%），當(dāng)pH值偏酸（pH 4～5）或偏堿（pH 9～11）時，MBSPI的抑制活性顯著下降，在pH 4和pH 11時，相對抑制活性僅有約20%（圖4B）。

使用MBSPI對不同種類絲氨酸蛋白酶進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)MBSPI僅對大黃魚MBSP存在較強(qiáng)抑制效果，相對抑制活性為70%，對鯽魚MBSP的相對抑制活性僅為10%，而對其他幾種絲氨酸蛋白酶及胰凝乳蛋白酶均不抑制（圖4C）。前期研究發(fā)現(xiàn)，海水白姑魚MBSPI也僅能夠抑制自身的MBSP，而對鯉魚MBSP不產(chǎn)生抑制作用。從鯽魚肌肉中純化的MBSPI對鯽魚MBSP起抑制作用，而對海水白姑魚MBSP無抑制作用。但是，鰱魚MBSPI可抑制同屬鯉科魚類的鯽魚MBSP的活性。顯然，MBSPI作為MBSP的內(nèi)源性抑制劑具有較強(qiáng)的特異性，即海水魚MBSPI僅對海水魚MBSP產(chǎn)生抑制作用，反之淡水魚亦然。分析原因可能如下：1）現(xiàn)已知的淡水鯽魚、鰱魚MBSPI均為多聚體形式，而海水狗母魚、白姑魚、大黃魚為單體形式，MBSPI寡聚狀態(tài)的不同可能導(dǎo)致抑制劑與酶結(jié)合的方式不同；2）淡水魚與海水魚MBSP的分子結(jié)構(gòu)、酶切位點存在差異，因此酶與抑制劑的結(jié)合位點也有所不同。

5 MBSPI對MBSP的抑制動力學(xué)

如圖5A所示，隨著MBSPI濃度增大，MBSP活性呈下降趨勢，經(jīng)計算得到其IC50為0.03 μmol/L。進(jìn)一步分析MBSPI對MBSP的抑制模式，如圖5B所示，在Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中，MBSPI在不同濃度下的擬合曲線與y軸正半軸交匯，表明此抑制劑不改變酶的最大反應(yīng)速度Vm，而酶的Km隨抑制劑濃度的增大而增大，表現(xiàn)為競爭型抑制。這表明MBSPI是通過與MBSP底物競爭MBSP的結(jié)合位點，從而影響底物與MBSP的結(jié)合。類似的，從鯽魚中純化得到的MBSPI與MBSP也表現(xiàn)出同樣的抑制類型。

6 MBSPI對大黃魚肌原纖維蛋白自身降解的影響

將大黃魚肌原纖維蛋白在不同溫度（40～70 ℃）條件下孵育1 h，肌原纖維蛋白中MHC的降解程度隨溫度升高呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢，其中在50～60 ℃范圍內(nèi)降解最為明顯（圖6A）。鯽魚肌原纖維蛋白也存在相同的降解現(xiàn)象，其在50～60 ℃條件下MHC存在明顯的降解現(xiàn)象，且長時間加熱還會導(dǎo)致α-輔肌動蛋白、Actin和TM的降解。肌原纖維蛋白中存在一種結(jié)合型的蛋白酶MBSP，該蛋白酶在50～60 ℃會對肌原纖維蛋白造成降解，且該降解過程以MHC為主，從而引起魚糜凝膠劣化。將MBSPI與大黃魚肌原纖維蛋白混合并在50 ℃條件下共孵育1 h，如圖6B所示，未添加MBSPI時，肌原纖維蛋白存在明顯降解，表明肌原纖維蛋白中存在內(nèi)源性蛋白酶；隨著MBSPI的加入，MHC降解程度降低，表明內(nèi)源性蛋白酶活性受到抑制，且抑制降解效果與MBSPI的添加量呈正相關(guān)。類似結(jié)果在鯽魚、鰱魚、白姑魚及狗母魚中也有報道。

7 MBSPI對MBSP引起的羅非魚肌原纖維蛋白降解的影響

為確定MBSP在肌原纖維蛋白自身降解中的作用及MBSPI對MBSP降解能力的抑制效果。本研究以自身降解較弱的羅非魚肌原纖維蛋白為底物，并將部分純化的MBSP與MBSPI預(yù)孵育后，對羅非魚肌原纖維蛋白進(jìn)行降解。如圖7所示，在4 ℃（不加熱）和50 ℃加熱條件下，羅非魚MHC均不存在降解現(xiàn)象，表明其肌原纖維蛋白中MBSP活性較弱甚至無活性。而加入MBSP后，MHC、Actin和TM均發(fā)生嚴(yán)重降解，表明MBSP在肌原纖維蛋白自身降解中起關(guān)鍵作用。隨著MBSPI濃度的增加，MHC、Actin和TM的降解程度得到顯著抑制，證明MBSPI可以抑制MBSP對肌原纖維蛋白的降解，且抑制效果與MBSPI的添加量呈正相關(guān)。綜上，MBSPI作為一種內(nèi)源性抑制劑可以通過抑制MBSP的活性，達(dá)到抑制肌原纖維蛋白自身降解的效果。

8 結(jié) 論

本研究以MBSP為靶標(biāo)酶，通過熱處理、離子交換層析等方法，從大黃魚肌肉中純化得到MBSP的內(nèi)源性抑制劑MBSPI。MBSPI是分子質(zhì)量為55 kDa的單體蛋白，其一級結(jié)構(gòu)與GPI高度同源，表明兩者為同一蛋白。MBSPI主要由α-螺旋構(gòu)成，熱變性溫度為53 ℃，較好的熱穩(wěn)定性保證MBSPI經(jīng)40 ℃處理后，對MBSP仍能維持60%以上的抑制活性。MBSPI對MBSP為競爭性抑制，且該抑制作用具有高度特異性，淡水魚與海水魚MBSPI分子質(zhì)量的差異可能是其抑制作用具有物種特異性的原因之一。此外，MBSPI還可有效抑制MBSP對肌原纖維蛋白的降解，且抑制效果與MBSPI的添加量呈正相關(guān)。本研究可為魚糜制品生產(chǎn)過程中高效回收水溶性MBSPI蛋白并將其作為魚糜凝膠增強(qiáng)劑提供理論參考。

引文格式：

霍衛(wèi)森, 張凌晶, 陳玉磊, 等. 大黃魚肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)分析[J].食品科學(xué), 2025, 46(24): 90-97. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250427-225.

HUO Weisen, ZHANG Lingjing, CHEN Yulei, et al. Purification and characterization of myofibril-bound serine proteinase inhibitor from Larimichthys crocea[J]. Food Science, 2025, 46(24): 90-97. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250427-225.

實習(xí)編輯：欒文莉；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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