腸道作為機體和外界接觸最為密切的器官之一，不僅是營養(yǎng)物質的主要消化和吸收器官，還作為一道重要的防御屏障，抵御腸腔中毒素、病原體和抗原等的入侵。目前，隨著全球老齡化進程加速及亞健康人群規(guī)模不斷擴大，腸道功能障礙相關問題在人群中變得越來越普遍。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激是誘發(fā)腸道屏障損傷的關鍵因素，可導致腸上皮細胞氧化還原失衡，活性氧（ROS）過量累積，使機體抗氧化酶活性降低和細胞膜通透性升高，從而破壞緊密連接蛋白的結構與表達，加劇細胞凋亡，最終導致腸道屏障功能障礙。然而，當前醫(yī)療體系針對腸道功能受損過度依賴抗生素等化學藥物，導致腸道微生態(tài)極易失衡，耐藥性增加，為腸道屏障功能障礙的治療帶來極大難度。在此背景下，大健康產(chǎn)業(yè)亟需轉向安全可持續(xù)的天然生物活性物質研究。

多酚作為植物中常見的天然物質，具有抗氧化、抗菌、抗炎和免疫調節(jié)等作用。目前已發(fā)現(xiàn)綠茶多酚、葡萄多酚和蘋果多酚具有降低炎癥反應調節(jié)自身平衡的作用。異綠原酸（ICGA）是經(jīng)植物體內有氧呼吸由莽草酸途徑中咖啡酸和奎寧酸縮合形成的酚酸，具有非抗生素特性、多靶點調節(jié)能力及腸道微生態(tài)友好性等特性，廣泛存在于甜葉菊、金銀花、杜仲等藥用植物中。ICGA屬于二咖啡酰奎寧酸類化合物，以異綠原酸A(ICGA-A）、異綠原酸B(ICGA-B）和異綠原酸C(ICGA-C)3種異構體（圖1）形式存在，在特定條件下3種異構體可互相轉化。2025年國家衛(wèi)生健康委員會1號文件發(fā)布了甜葉菊多酚作為新食品原料公告，甜葉菊多酚的生物活性將備受食品研發(fā)人員的關注。在畜禽生產(chǎn)中也證實，甜葉菊ICGA可調節(jié)腸道上皮細胞的增殖和凋亡，降低腸道黏膜上皮的通透性，進而緩解炎癥損傷并提高畜禽生長性能。

河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院的程文麗、田益玲*，河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院的郭云霞*等人通過研究甜葉菊提取物中多酚和ICGA的含量，從細胞存活率、抗氧化酶活性及腸道相關基因表達等方面，探究甜葉菊提取物ICGA對H2O2誘導的小腸上皮細胞氧化損傷的保護作用，以期為ICGA在緩解腸道氧化損傷領域提供理論依據(jù)。

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甜葉菊提取物中的總多酚含量

以沒食子酸標準液的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標得到標準曲線的回歸方程為y=0.111 8x-0.01,R2=0.999，線性關系良好，可以用于總多酚含量的測定。在相同的條件下測定甜葉菊提取物的吸光度，通過式（1）計算出樣品中總多酚含量為676.8 mg/g，占比為67.68%。

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甜葉菊提取物中的ICGA含量

以對照品3種ICGA質量濃度（x,mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，所得回歸方程和決定系數(shù)見表3。甜葉菊提取液樣品高效液相色譜分析結果如圖2所示，根據(jù)保留時間可以看出樣品中含有ICGA 3種同分異構體，即ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C。通過將峰面積帶入標準曲線計算得出，ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C在樣品中的質量分數(shù)分別為20.6%、20.4%和23.2%，三者總占比達到64.23%，其中ICGA-C占比最高。ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C在樣品中總多酚的占比達到了94.90%。

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H2O2誘導IPEC-J2細胞損傷

如圖3所示，當H2O2濃度在100～200 μmol/L時，細胞的存活率在50%左右，當H2O2濃度大于200 μmol/L后，細胞存活率極低。細胞存活率過低時不利于模型的構建，所以只討論H2O2濃度在100～200 μmol/L時細胞的存活情況。在此濃度范圍內，細胞的存活率與作用時間無顯著關系（P>0.05）。因此，初步選定100 μmol/L H2O2和200 μmol/L H2O2處理1 h作為構建細胞氧化應激模型的條件。

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H2O2誘導IPEC-J2細胞氧化應激

如圖4所示，細胞經(jīng)不同濃度的H2O2處理1 h后，與對照組相比，各組的M D A含量都顯著上升（P<0.05），其中，200 μmol/L H2O2組顯著高于100 μmol/L H2O2組（P<0.05)；CAT和GSH-Px活性都顯著下降（P<0.05），且200 μmol/L H2O2組顯著低于100μmol/L H2O2組（P<0.05）；各處理組SOD活性和T-AOC均顯著低于對照組（P<0.05）。最終確定200 μmol/L H2O2處理細胞1 h構建氧化應激損傷模型。

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甜葉菊提取物ICGA對IPEC-J2細胞存活率的影響

如圖5所示，細胞添加含不同濃度的ICGA甜葉菊提取物溶液作用12 h后與對照組相比，隨著ICGA作用濃度的上升，IPEC-J2細胞存活率先上升然后下降。當作用濃度由10 μmol/L增加到50 μmol/L時，細胞存活率由99.06%增加到111.77%；當作用濃度增加到100 μmol/L時，細胞的存活率開始下降，此時存活率為97.41%；當作用濃度由100 μmol/L增加到400μmol/L時，細胞存活率持續(xù)下降至5.25%。說明一定濃度的ICGA對細胞有增殖促進作用，但濃度過大時，會對細胞產(chǎn)生抑制作用，導致細胞死亡。當甜葉菊提取物中ICGA的濃度在0～100 μmol/L時對細胞基本無毒性。因此確定ICGA濃度50 μmol/L和100 μmol/L、作用時間12 h用于后續(xù)實驗。

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甜葉菊提取物ICGA緩解H2O2誘導的IPEC-J2細胞損傷

如圖6所示，模型組的細胞存活率為77.49%，與對照組相比，顯著下降了22.51%(P<0.05);ICGA預保護組中，50 μmol/L ICGA組的細胞存活率為90.23%，比模型組顯著提高了16.44%(P<0.05);100 μmol/L ICGA組的細胞存活率為95.99%，比模型組顯著提高了23.87%(P<0.05）。表明ICGA預保護能能顯著緩解H2O2模型造成的細胞存活率下降的情況。

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甜葉菊提取物ICGA提高H2O2處理下IPEC-J2細胞的抗氧化能力

如圖7所示，與模型組相比，I C G A預保護組MDA含量均顯著降低（P<0.05）；對于CAT和SOD活性以及T-AOC,ICGA預保護組均顯著高于模型組（P<0.05）；其中100 μmol/L ICGA組T-AOC顯著高于50 μmol/L ICGA組（P<0.05）。表明ICGA能通過提高機體的抗氧化能力以及降低MDA的累積緩解H2O2誘導的氧化應激損傷。

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甜葉菊提取物ICGA提高H2O2處理下IPEC-J2細胞的緊密連接基因表達水平

如圖8所示，與對照組相比，模型組顯著降低了細胞中Occludin、ZO-1和Claudin-1的mRNA相對表達量（P<0.05）。與模型組相比，50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA預保護組均顯著提升了細胞中Occludin和Claudin-1的m R N A相對表達量（P<0.0 5);100 μmol/L ICGA預保護組還顯著提升了細胞中ZO-1的mRNA相對表達量（P<0.05）。50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA兩個預保護組相比，100 μmol/L ICGA預保護組細胞中Occludin的mRNA相對表達量顯著高于50 μmol/L ICGA組（P<0.05）。

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甜葉菊提取物ICGA降低H2O2處理下IPEC-J2細胞凋亡相關基因的表達水平

如圖9所示，與對照組相比，模型組顯著降低了細胞中Bcl-2的mRNA相對表達量（P<0.05），顯著提升了細胞中Caspase-3的mRNA相對表達量（P<0.05）。與模型組相比，100 μmol/L ICGA預保護組顯著提升了細胞中Bcl-2的mRNA相對表達量（P<0.05),50 μmol/L ICGA組和100 μmol/L ICGA預保護組均顯著降低了細胞中Caspase-3的mRNA相對表達量（P<0.05）。50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA兩個預保護組相比，100 μmol/L ICGA預保護組Bcl-2的mRNA相對表達量顯著高于50 μmol/L ICGA組（P<0.05），而Caspase-3的mRNA相對表達量顯著低于50 μmol/L ICGA組（P<0.05）。

10

結 論

甜葉菊不僅是天然的甜味劑和降糖成分，其提取物還具備抗菌防腐、心血管調節(jié)、抗炎免疫和代謝調控等多重功效，而甜葉菊多酚是從甜葉菊葉片中提取的多酚類化合物，主要含綠原酸衍生物和黃酮等活性成分，因其顯著的抗氧化、抗菌和抗炎特性，在食品工業(yè)中廣泛應用，2025年我國已正式批準其為新食品原料。與其他植物（金銀花、咖啡豆、杜仲）對比，甜葉菊中的ICGA含量明顯較高，且相較于綠原酸，多一個咖啡?；鶊F的ICGA表現(xiàn)出更強的抗炎、抑菌、抗氧化、抗病毒活性。ICGA以A、B、C 3種同分異構體的形式在植物體中存在，但3種異構體在溶液中極不穩(wěn)定，在一定條件下可發(fā)生相互轉化。Park的研究表明，這3種ICGA同分異構體均能有效抑制H2O2誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的凋亡。Iwai等指出，在ICGA中相較于另外2種同分異構體，ICGA-C的抗氧化活性最強，推測這可能是由于其結構中的兩個咖啡?；鶊F間距最遠，空間位阻較小，使得鄰二酚羥基得以更充分地暴露，從而更有效地與自由基反應或與酶的活性位點結合。本實驗中發(fā)現(xiàn)，甜葉菊提取物中總多酚占比67.68%，其中包含ICGA-A、ICGA-B和ICGA-C 3種同分異構體，其質量分數(shù)分別為20.6%、20.4%和23.2%，三者總質量分數(shù)達到64.23%,ICGA-C相對含量最多，ICGA的含量占總多酚含量的94.90%，這也是甜葉菊提取物具有抗氧化功能的關鍵。ICGA類物質能激活核因子E2相關因子2(Nrf2）等抗氧化信號通路，增強細胞內源性抗氧化酶的表達，減輕氧化損傷，又能抑制核因子κB(NF-κB）等經(jīng)典炎癥信號通路的過度活化，降低促炎因子的水平，直接緩解炎癥。

IPEC-J2細胞是一種從新生仔豬空腸中分離的非轉化型腸上皮細胞系，因其源于正常小腸組織且保留未轉化特性，相比其他常用模型更能代表生理狀態(tài)的腸道環(huán)境，被廣泛用于腸道屏障功能及氧化應激等方面的研究。H 2 O 2 可誘導細胞產(chǎn)生過量的ROS，過量ROS產(chǎn)生和自由基的形成會導致氧化應激，從而損傷細胞、組織和器官，此時，除了細胞的存活率發(fā)生變化外，CAT、SOD、GSH-Px活性、T-AOC以及MDA含量也會發(fā)生相應的變化，同時也是判斷細胞是否受到氧化應激的重要依據(jù)。金鹿等基于奶牛乳腺上皮細胞的細胞活性及抗氧化指標篩選確定600 μmol/L H 2 O 2 處理6 h為最佳建模條件。孫婧陶等通過延邊奶山羊乳腺上皮細胞的活性、凋亡狀態(tài)及ROS水平綜合評估發(fā)現(xiàn)100μmol/L H 2 O 2 處理4 h即可有效建立氧化損傷模型。由此可見，細胞類型、培養(yǎng)微環(huán)境參數(shù)等的不同，均可能導致其構建氧化損傷模型的作用時間和濃度存在顯著差異。研究者通常將半數(shù)細胞存活率對應的處理參數(shù)作為核心優(yōu)化指數(shù)。如果細胞存活率過高，表明細胞沒有受到明顯的損傷，不利于進行后續(xù)實驗；存活率過低，細胞大量死亡造成不可逆的損傷，亦不利于后續(xù)實驗的進行。本實驗以IPEC-J2細胞的存活率達50%左右為標準，對H 2 O 2 作用濃度及作用時間進行初步篩選。結果發(fā)現(xiàn)，當100 μmol/L H 2 O 2 和200 μmol/L H 2 O 2 作用細胞1 h時的細胞存活率分別為67.31%和50.86%，此時并沒有造成細胞大量死亡，還有進行自我修復的可能性。結合抗氧化指標檢測發(fā)現(xiàn)IPEC-J2細胞經(jīng)100 μmol/L和200 μmol/L H 2 O 2 處理1 h后均顯著降低了CAT、SOD、GSH-Px活性和T-AOC，顯著提高了MDA含量，且200 μmol/L H 2 O 2 對IPEC-J2產(chǎn)生的氧化應激效果更好。因此，最終將200 μmol/L H 2 O 2 處理1 h作為IPEC-J2細胞氧化應激損傷的條件。

在抗氧化系統(tǒng)中的酶是體內抗氧化的重要途徑之一，其中SOD可將ROS通過歧化反應生成H 2 O 2 ，H 2 O 2 在CAT的作用下被分解為水和氧氣，從而緩解機體氧化損傷。甜葉菊提取物可通過降低巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮，顯著提高SOD活性并降低MDA含量，減輕機體自由基損傷，進而緩解脂多糖誘導的巨噬細胞氧化應激。ICGA的抗氧化活性可能既源于其分子結構中的酚羥基直接清除ROS（如羥自由基和超氧陰離子自由基），又通過激活Nrf2信號通路調控下游基因表達，顯著增強機體抗氧化酶活性并減少MDA的積累，從而共同保護組織免受氧化損傷。在小反芻獸疫病毒感染非洲綠猴腎Vero細胞中，焦豪杰也發(fā)現(xiàn)，ICGA-A能提高SOD活性，降低ROS含量和MDA含量，進而緩解病毒感染導致的宿主細胞氧化應激損傷，提高宿主細胞活力。本實驗結果表明，50 μmol/L ICGA和100 μmol/L ICGA處理氧化應激模型后，細胞存活率比模型組顯著提高了16.44%和23.87%，50 μmol/L和100 μmol/L ICGA處理均顯著提高了CAT、SOD活性和T-AOC，顯著降低了MDA含量，且100 μmol/L ICGA預處理組T-AOC顯著高于50 μmol/L ICGA組，表明甜葉菊提取物ICGA能夠緩解H 2 O 2 誘導的IPEC-J2細胞氧化應激損傷，提高細胞增殖能力。

緊密連接是腸道屏障的核心結構，主要由跨膜蛋白Occludin、Claudins家族及外周膜蛋白ZO家族等共同構成。Occludin通過磷酸化控制ZO-1蛋白，進而調節(jié)緊密連接的穩(wěn)定性和通透性，ZO蛋白充當橋梁，將Occludin和Claudin等連接蛋白連接到肌動蛋白細胞骨架，這些蛋白相互作用維持緊密連接的形成和功能。Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者而Bcl-2是抗凋亡蛋白家族的核心成員。本實驗中，經(jīng)過H 2 O 2 誘導后，與對照組相比，模型組細胞中Claudin-1、ZO-1、Occludin和Bcl-2的mRNA相對表達量均顯著降低，Caspase-3的mRNA相對表達量顯著上升，這與Zhong Yajing等的報道一致，表明H 2 O 2 能夠通過造成氧化應激破壞腸道形態(tài)的完整性，增加腸道通透性，影響腸道的正常功能。ICGA在幼畜日糧中添加可改善小腸絨毛形態(tài)結構，促進腸道Occludin和ZO-1基因的表達，增強腸道機械屏障功能。在對阿爾茨海默病的干預實驗中發(fā)現(xiàn)ICGA-A可激活表皮生長因子受體/Ras/細胞外信號調節(jié)激酶信號通路，顯著提高細胞活力，逆轉損傷組促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9和Bax的mRNA和蛋白水平升高的同時降低抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白水平。本研究發(fā)現(xiàn)，細胞經(jīng)過ICGA預處理后，能夠顯著緩解H 2 O 2 引起的Occludin和Claudin-3的mRNA相對表達量的下降，顯著緩解Caspase-3的mRNA相對表達量的上升；其中100 μmol/L ICGA預處理組還能顯著緩解ZO-1和Bcl-2的mRNA相對表達量下降，這可能與ICGA通過激活Nrf2抗氧化通路增強Bcl-2的轉錄和提高抗凋亡蛋白水平，同時通過抑制NF-κB信號通路減少促炎因子的釋放，從而阻斷Caspase-3上游激活信號，從而降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達有關。

綜上，含100 μmol/L ICGA的甜葉菊提取物可通過提高抗氧化酶CAT、SOD的活性和T-AOC，降低MDA累積，且上調腸上皮細胞的緊密連接基因Occludin、ZO-1和Claudin-1的mRNA和抗凋亡Bcl-2相對表達量，下調促凋亡Caspase-3相對表達量，進而緩解H 2 O 2 引起的腸上皮細胞的氧化應激損傷，為開發(fā)安全可持續(xù)的天然生物活性物質以緩解現(xiàn)代生活中人體日益加劇的氧化應激負荷現(xiàn)象提供了理論支撐。

引文格式：

程文麗，郝慶紅，袁宇婷，趙鵬宇，錢周澤，郭云霞，田益玲. 甜葉菊提取物異綠原酸對過氧化氫誘導的腸上皮細胞損傷的保護作用[J]. 食品科學, 2025, 46(23): 215-224.

CHENG Wenli, HAO Qinghong, YUAN Yuting, et al. Protective effect of isochlorogenic acid extracted from Stevia rebaudiana against hydrogen peroxide-induced intestinal epithelial cell injury[J]. Food Science, 2025, 46(23): 215-224.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250624-164.

實習編輯：李杭生；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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