染色質(zhì)可及性是指染色質(zhì)DNA與調(diào)控分子相互作用的開放程度，其開放區(qū)域常與啟動子、增強子等調(diào)控元件相關(guān)，對理解基因調(diào)控、細胞分化及疾病發(fā)生至關(guān)重要。隨著單細胞ATAC-seq技術(shù)快速發(fā)展，研究者能夠在單細胞分辨率下探索染色質(zhì)開放圖譜。然而，與RNA-seq擁有成熟的轉(zhuǎn)錄組參考不同，ATAC-seq領(lǐng)域一直缺乏標準化的特征參考集，導致數(shù)據(jù)分析時需依賴數(shù)據(jù)集特異性峰調(diào)用或固定窗口劃分，難以實現(xiàn)跨數(shù)據(jù)集的整合與比較，也限制了稀有細胞類型的識別。

近日，清華大學自動化系張學工團隊與魏磊團隊在《Nature Communications》上發(fā)表題為《A generic reference defined by consensus peaks for single-cell ATAC-seq data analysis》的研究論文。該研究通過整合624個高質(zhì)量bulk ATAC-seq數(shù)據(jù)集，構(gòu)建了約140萬個共識峰作為染色質(zhì)可及性分析的通用參考集cPeaks，并結(jié)合深度學習模型擴展了約28萬個預測峰，為單細胞ATAC-seq數(shù)據(jù)分析提供了標準化特征參考。清華大學張學工教授與魏磊博士為本文的共同通訊作者；孟秋辰博士與碩士生吳鑫澤為該論文的共同第一作者。

研究團隊首先整合ENCODE和ATACdb數(shù)據(jù)庫中健康成人樣本的624個bulk ATAC-seq數(shù)據(jù)集，通過迭代合并重疊峰，獲得約120萬個合并峰。這些峰呈現(xiàn)出高度一致的形態(tài)特征，無論組織類型、測序技術(shù)或峰調(diào)用方法如何變化，其形態(tài)相關(guān)性均保持穩(wěn)定。進一步分析發(fā)現(xiàn)，部分合并峰呈現(xiàn)多峰形態(tài)，團隊將其分解為多個單峰單元，最終獲得約140萬個觀察cPeaks，其中多數(shù)長度小于2000 bp，中位長度為525 bp。

為擴展cPeaks對未見細胞類型的覆蓋能力，研究團隊基于scBasset架構(gòu)開發(fā)了一維卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。該模型以cPeaks序列為正樣本、背景區(qū)域為負樣本進行訓練，在測試集上AUC達94.72%。通過留一組織類型的交叉驗證，模型能有效預測被排除的組織特異性cPeaks，平均AUC達91.67%。團隊利用訓練好的模型以500 bp滑動窗口掃描全基因組，篩選出約28萬個預測cPeaks，在獨立的789個bulk ATAC-seq數(shù)據(jù)集中驗證顯示，加入預測cPeaks后覆蓋度顯著提升。

通過整合ChIP-seq、組蛋白修飾等多組學數(shù)據(jù)，研究團隊對cPeaks進行了功能注釋。約13%的cPeaks位于啟動子區(qū)域，其余分布于外顯子或遠端基因間區(qū)。基于可及比例定義出24，538個管家cPeaks，其中77.4%與已知管家基因啟動子重疊。團隊還基于cPeaks形態(tài)特征將其分為“精確定位”、“不對稱定位”和“弱定位”三類，發(fā)現(xiàn)精確定位cPeaks邊界附近富集了CTCF、Fosl2等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序，且與先鋒轉(zhuǎn)錄因子顯著相關(guān)。

在細胞類型注釋任務(wù)中，研究團隊以造血分化數(shù)據(jù)集為測試對象，比較cPeaks與基因組窗口、偽批量峰、聯(lián)合峰、cDHS和CATLAS cCREs等五種特征集的表現(xiàn)。cPeaks在調(diào)整蘭德指數(shù)、調(diào)整互信息和同質(zhì)性等指標上均表現(xiàn)最佳，尤其在特征選擇后優(yōu)勢更為明顯。在ArchR分析流程中，cPeaks經(jīng)過一輪迭代即可優(yōu)于其他特征集多輪迭代的結(jié)果，在PBMC-DOGMA數(shù)據(jù)集上也驗證了這一優(yōu)勢。

針對稀有細胞類型識別這一難點，研究團隊在PBMC-8k數(shù)據(jù)集上比較了不同特征集對漿細胞樣樹突狀細胞的識別能力。cPeaks的預測分數(shù)顯著高于其他參考集，差異可及區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，cPeaks鑒定出更多pDC特異性開放區(qū)域，包括PTCRA基因啟動子區(qū)，其表達在scRNA-seq數(shù)據(jù)中也呈現(xiàn)pDC特異性。在包含48，487個細胞的PBMC-48k數(shù)據(jù)集和CATLAS胃腸上皮細胞亞型分析中，cPeaks均展現(xiàn)出優(yōu)異的稀有亞型分辨能力。

在發(fā)育生物學應(yīng)用中，團隊利用cPeaks分析人胎兒視網(wǎng)膜發(fā)育數(shù)據(jù)集，成功重現(xiàn)了從多能祖細胞到水平細胞、視錐細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的發(fā)育軌跡。通過計算精確定位cPeaks在總開放cPeaks中的比例，發(fā)現(xiàn)該比值在細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變期顯著升高，后期發(fā)育階段下降。在人胎兒細胞圖譜和CATLAS成人數(shù)據(jù)集的對比分析中，大多數(shù)共享細胞類型的胎兒樣本精確定位cPeaks比例高于成人樣本。

在腫瘤研究應(yīng)用中，團隊利用cPeaks分析婦科惡性腫瘤單細胞ATAC-seq數(shù)據(jù)，成功區(qū)分了GIST、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細胞與正常細胞。在8號樣本的卵巢癌細胞中發(fā)現(xiàn)兩個具有不同CNV特征和染色質(zhì)可及性特征的亞克隆。分析精確定位cPeaks比例在腫瘤進展中的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)從早期到中期上升、后期略有下降的非單調(diào)趨勢，并在獨立肝細胞癌數(shù)據(jù)集中驗證了這一現(xiàn)象。

研究團隊已將cPeaks資源整合至SnapATAC和ArchR等主流分析平臺，并提供獨立Python腳本支持自定義分析流程。完整的cPeaks列表包含ID、來源、基因組坐標、管家狀態(tài)、形態(tài)模式、調(diào)控元件推斷及與cDHS、CATLAS cCREs、ReMap的對應(yīng)關(guān)系等信息，為單細胞ATAC-seq數(shù)據(jù)標準化分析提供了重要基礎(chǔ)。

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