小鼠卵巢儲(chǔ)備衰退模型

前言

小鼠卵巢儲(chǔ)備衰退（Ovarian Reserve Decline, ORD）是指小鼠卵巢內(nèi)原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡數(shù)量減少，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，伴隨卵巢內(nèi)分泌功能減退的病理生理過(guò)程，是生殖醫(yī)學(xué)、衰老研究及女性生殖健康相關(guān)機(jī)制研究的核心模型之一（小鼠是模擬人類(lèi)卵巢早衰、衰老相關(guān)卵巢功能減退的經(jīng)典模式生物）。

圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)

01 構(gòu)建方法

一、化學(xué)誘導(dǎo)模型

1. 環(huán)磷酰胺（CTX）聯(lián)合白消安（Bu）方案

機(jī)制：CTX 通過(guò)烷基化損傷 DNA，誘導(dǎo)原始卵泡提前激活并閉鎖；Bu 則直接破壞卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞。

劑量與操作：

C57BL/6 小鼠：?jiǎn)未胃骨蛔⑸?CTX 120 mg/kg + 皮內(nèi)注射 Bu 12 mg/kg，可顯著降低卵巢儲(chǔ)備（卵泡密度降至對(duì)照的 37%），同時(shí)保留部分生育力，適用于化療后殘留卵巢功能研究。

昆明鼠：腹腔注射 CTX 40 mg/kg 連續(xù) 5 天，可觀察到體重減輕、精子數(shù)量減少（雄性模型），提示雌性可能需調(diào)整劑量。

評(píng)估指標(biāo)：卵巢組織學(xué)（原始 / 竇卵泡計(jì)數(shù)）、血清 AMH（抗繆勒管激素）降低、動(dòng)情周期紊亂（動(dòng)情期縮短或消失）。

優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)便、周期短（2-4 周），可模擬醫(yī)源性卵巢損傷；殘留卵泡質(zhì)量未受顯著影響，適合卵巢保護(hù)策略研究。

參考文獻(xiàn)-Study on the effects and mechanisms of Wenzhong Bushen Formula in improving ovarian reserve decline in mice based on network pharmacology

2. 雷公藤多苷（TWP）模型

機(jī)制：抑制顆粒細(xì)胞增殖和甾體激素合成，誘導(dǎo)卵泡閉鎖。

劑量：50 mg/kg 灌胃 14 天，可致卵巢指數(shù)降低、AMH 和雌激素水平下降，卵母細(xì)胞成熟率減少。

特點(diǎn)：副作用較少，但需長(zhǎng)期給藥，適合研究慢性卵巢損傷。

二、自然衰老模型

1. 自然衰老

方法：飼養(yǎng) C57BL/6 小鼠至 9-12 月齡（相當(dāng)于人類(lèi)圍絕經(jīng)期）。

特征：卵巢纖維化加劇、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（淋巴細(xì)胞比例增加 1 倍）、膠原酶（MMP2）表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致膠原沉積。

優(yōu)勢(shì)：接近人類(lèi)生理衰老過(guò)程；缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)，個(gè)體差異大。

三、基因編輯模型

1. 關(guān)鍵基因敲除

miR-199b-5p 敲除：通過(guò) CRISPR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建，表現(xiàn)為產(chǎn)仔數(shù)減少（平均每窩 6.43 vs 8.15 只），卵巢中 H12 基因表達(dá)升高，RS13 和 RL6 基因表達(dá)降低，提示 DNA 損傷修復(fù)和核糖體功能異常。

FoxO3a 卵巢特異性敲除：原始卵泡過(guò)度激活，導(dǎo)致儲(chǔ)備提前耗竭，模擬遺傳性卵巢早衰。

優(yōu)勢(shì)：機(jī)制明確，可模擬遺傳性 DOR；缺點(diǎn)是技術(shù)門(mén)檻高，周期長(zhǎng)（需 2-3 個(gè)月）。

2. 衰老相關(guān)基因干預(yù)

CD38 敲除：通過(guò)減少 NAD + 消耗，逆轉(zhuǎn)卵巢衰老相關(guān)的細(xì)胞通訊異常和纖維化，適用于抗衰老機(jī)制研究。

四、其他模型

1.半乳糖模型

機(jī)制：35% 半乳糖飲食誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致卵泡耗竭和卵巢纖維化。

評(píng)估：卵巢重量減輕、E2 降低、FSH 升高，輸卵管成熟卵母細(xì)胞數(shù)減少。

注意：需結(jié)合肝臟損傷評(píng)估（如肝組織 HE 染色），避免代謝副作用干擾。

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02 文獻(xiàn)分享

參考文獻(xiàn)：Study on the effects and mechanisms of Wenzhong Bushen Formula in improving ovarian reserve decline in mice based on network pharmacology

中文翻譯：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的溫中補(bǔ)腎方改善小鼠卵巢儲(chǔ)備衰退的作用及機(jī)制研究

期刊：《Journal of Ethnopharmacology》 ( IF 5.4/Q1 )

民族藥理學(xué)相關(guān)性：溫中止腎方（WZBSF）是一種傳統(tǒng)中藥經(jīng)驗(yàn)方，以益氣、健脾、溫腎、壯陽(yáng)、活血、調(diào)經(jīng)為主要功效。臨床證據(jù)表明，其通過(guò)改善卵巢儲(chǔ)備功能，在治療卵巢儲(chǔ)備功能減退（DOR）方面具有顯著療效。然而，溫中止腎方具體的藥理作用機(jī)制仍不明確。

研究目的：本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究溫中止腎方改善卵巢儲(chǔ)備功能下降的作用機(jī)制。

材料與方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用平臺(tái)對(duì)溫中止腎方進(jìn)行分析。從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）獲取溫中止腎方的有效成分及靶點(diǎn)，并通過(guò)通用蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。從基因卡片數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCard）、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、藥物基因組學(xué)知識(shí)庫(kù)（PHARMGKB）和人類(lèi)疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）收集疾病靶點(diǎn)，并對(duì)兩組靶點(diǎn)進(jìn)行交叉比對(duì)。利用 cytoscape3.9.1 軟件和STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，隨后通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）和基因本體（GO）富集分析。最后，建立小鼠卵巢儲(chǔ)備功能下降模型，給予不同劑量的溫中止腎方，通過(guò)血清激素檢測(cè)、蘇木精-伊紅（H&E）染色、免疫熒光（IF）、免疫組織化學(xué)（IHC）及蛋白質(zhì)印跡分析（WB）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

結(jié)果：溫中止腎方與卵巢儲(chǔ)備功能下降存在145個(gè)共同靶點(diǎn)。GO富集分析顯示，其涉及激素刺激反應(yīng)、磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程；KEGG分析表明，其與磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號(hào)通路、叉頭框蛋白O（FoxO）信號(hào)通路等相關(guān)。在卵巢儲(chǔ)備功能下降的小鼠中，溫中止腎方恢復(fù)了體重增長(zhǎng)率，提高了卵巢指數(shù)，使動(dòng)情周期恢復(fù)正常，逆轉(zhuǎn)了血清激素失衡，恢復(fù)了各類(lèi)卵泡數(shù)量，并改善了卵巢形態(tài)。此外，溫中止腎方降低了磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）和磷酸化叉頭框蛋白O3a（p-FOXO3a）的水平，防止了原始卵泡的過(guò)度激活，維持了卵巢儲(chǔ)備功能。

結(jié)論：溫中止腎方可改善環(huán)磷酰胺和白消安誘導(dǎo)的卵巢儲(chǔ)備功能下降，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/FOXO3a信號(hào)通路有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)流程圖

1、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)WZBSF治療DOR的潛在機(jī)制。

2、不同處理組小鼠給藥后的一般狀況。

3、不同組小鼠發(fā)情周期及血清激素水平的變化。

4、不同組的卵巢形態(tài)學(xué)和卵泡計(jì)數(shù)。

5、不同組的卵巢儲(chǔ)備狀態(tài)。

6、WZBSF通過(guò)PI3K/AKT/FOXO3a信號(hào)通路改善DOR小鼠卵巢功能。

7、本研究機(jī)制示意圖。

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