本文系Food Science and Human Wellness原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請授權(quán)。

01

Introduction

檸檬精油，尤其是冷榨檸檬精油，由于天然檸檬香氣在世界范圍內(nèi)被接受，幾十年來在香精香料行業(yè)中用途廣泛。此外，檸檬味的清爽和活力特性與當(dāng)前自然轉(zhuǎn)變飲食趨勢以及全球后疫情市場形勢相匹配。因此，大多數(shù)研究都集中在檸檬精油中約96%～99%的揮發(fā)性部分。檸檬油中剩余的1%～4%非揮發(fā)物長期以來一直被忽視或忽視，因為它們不被認為是獨特檸檬風(fēng)味的香氣貢獻因素。這種非揮發(fā)性組分由類胡蘿卜素、脂肪酸、甾醇、香豆素和呋喃香豆素組成。香豆素和呋喃香豆素（即呋喃香豆素）稱為氧雜環(huán)化合物（OHCs，圖1）。

圖1 檸檬油中的OHCs

眾所周知，檸檬精油的摻假很常見，因為它的需求未得到滿足且成本高。摻假最典型和最常見的方法是添加較低質(zhì)量的蒸餾油、洗滌油或具有獨特香氣的萜烯，例如檸檬醛、乙酸橙皮醇、乙酸香葉酯等。一些研究集中在對映氣相色譜（GC）上或GC-燃燒-同位素比質(zhì)譜法分析以確定檸檬油的真?zhèn)?，但這些儀器價格昂貴、難以維護，并且通常在大多數(shù)香精香料公司和學(xué)術(shù)實驗室中不可用。另一方面，非揮發(fā)性餾分，特別是OHC，在蒸餾油、萜烯和洗滌油中含量極少或不存在。在食品化學(xué)法典（FCC）中，冷榨檸檬油標準之一是在315 nm處測量其紫外線吸光度，這是OHC的最大紫外線吸光度波長。摻假者有時可以在劣質(zhì)檸檬油中加入少量冷榨酸橙精油，以使摻假的檸檬油符合質(zhì)量標準，因為酸橙油中的非揮發(fā)性物質(zhì)含量高出約8～10倍。同時，添加冷榨酸橙精油可以改善感官評價的結(jié)果，因為它比檸檬油含有更多的醛和酯。7-甲氧香豆素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯是冷壓檸檬精油中的主要OHCs，但根據(jù)文獻報道，檸檬油中應(yīng)不存在。

OHCs的分析因其低揮發(fā)性和熱耐性而在不同的GC技術(shù)中受到限制。與GC相關(guān)技術(shù)相比，高效液相色譜（HPLC）或超高效液相色譜（UPLC）更適合此類分析。近二十年來，越來越多的研究集中在柑橘精油中的非揮發(fā)性物質(zhì)上。據(jù)稱有兩個主要原因：1）潛在的生物活性，例如橙油中發(fā)現(xiàn)的多甲氧基黃酮的抗炎和抗癌作用，以及檸檬、酸橙和佛手柑油中的香豆素；2）與精油中發(fā)現(xiàn)的呋喃香豆素有關(guān)的化妝品應(yīng)用的光毒性調(diào)節(jié)。到目前為止，圖1中列出的常見OHCs與揮發(fā)性組分相比更復(fù)雜，但研究較少，因為商業(yè)上無法獲得，成本非常高，并且對于不同的冷榨柑橘精油具有很強的物種特異性。所有這些因素都表明，非揮發(fā)性O(shè)HCs餾分的分析優(yōu)于真實性研究。此外，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性，通過液相色譜法進行OHCs分析面臨許多共洗脫情況。最近，高分辨率質(zhì)子NMR已與其他化學(xué)計量學(xué)方法相結(jié)合，用于研究天然產(chǎn)物的真實性或來源。雖然1H核磁共振（NMR）可以通過簡單的樣品制備提供全面的數(shù)據(jù)，這種分析技術(shù)需要高度熟練的操作員，并且對于大多數(shù)質(zhì)量控制（QC）部門來說，在儀器和數(shù)據(jù)分析方面成本過高。另一種值得注意的OHCs分析方法是超臨界流體色譜（SFC）與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用。這種方法靈敏度高，分析時間短得多，而且用量少了有機溶劑。然而，維護串聯(lián)質(zhì)譜的成本和精力也超出了大多數(shù)QC部門的承受能力，并且仍然通過SFC-UV進行共洗脫。此外，HPLC系統(tǒng)在香精香料行業(yè)比SFC更容易獲得，因為它對不同分子具有多功能性。

在這項研究中，收集了124個直接從可靠的檸檬生產(chǎn)商那里供應(yīng)的正宗檸檬油樣品，以及來自不同香精香料公司的30個商業(yè)檸檬油樣品。通過經(jīng)過驗證的HPLC-UV方法分析所有樣品的OHCs組分。目前，檸檬油的主要QC分析因其應(yīng)用目的而由GC進行測試，真實性尚無定論且缺乏權(quán)威性。因此，通過HPLC-UV鑒定和量化OHCs來確定檸檬精油的真?zhèn)巫兊酶佑星巴竞蛯嶋H適用。利用來自該行業(yè)的正宗和商業(yè)摻假檸檬精油樣品，建立了一個基于不同水平OHCs含量和模式的內(nèi)部檸檬油數(shù)據(jù)庫。通過比較各種樣本中的OHCs概況，確定了OHCs的最重要因素，并進一步建立了一個統(tǒng)計模型來協(xié)助認證過程。本研究的主要目的是使用HPLC-UV表征和分析天然檸檬油中的OHCs，并使用真實樣品建立OHCs概況和統(tǒng)計模型。首先，進行了GC和HPLC分析，以確定來自商業(yè)來源的正宗和摻假檸檬精油的概況。然后，使用正向逐步邏輯回歸（FSLR）對不同真實檸檬油樣品的OHCs進行了完整的數(shù)據(jù)分析，以從OHCs中選擇最穩(wěn)健的預(yù)測因子進行目標真實性分類。最后，在樣本池上使用了5倍交叉驗證方法，以驗證FSLR結(jié)果中預(yù)測變量的性能。本研究提供了一種可行、可靠和有效的方法，通過使用HPLC-UV進行靶向OHCs分析來確定全球飲料、食品、香精香料行業(yè)使用的檸檬油的真?zhèn)巍?/p>

02

Results

HPLC方法驗證

根據(jù)初步實驗，在大多數(shù)正宗的檸檬油樣品中鑒定出少量的7-甲氧香豆素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯。因此，有必要驗證本研究中使用的HPLC方法。根據(jù)國際人用藥品注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)會議制定的指南，該方法在線性、LOD、LOQ、準確度和回收率、日內(nèi)和日間精密度以及重現(xiàn)性方面進行了驗證分析程序驗證。

根據(jù)標準化合物的校準曲線確定線性。由于檸檬精油中不同OHCs的濃度差異很大，因此根據(jù)它們在檸檬和酸橙精油中的典型范圍設(shè)定了濃度范圍（表1）。采用回歸分析評估線性度。所有15種標準化合物的5點校準曲線在濃度范圍內(nèi)均呈線性，相關(guān)系數(shù)較高（R2）值高于0.999。進一步稀釋標準化合物以確定靈敏度。LOD設(shè)置為信噪比的3倍，LOQ設(shè)置為信噪比的10倍。表1中的結(jié)果表明，這15種化合物的LOD在0.0134～0.0706 mg/L的范圍內(nèi)，它們的LOQ在0.01073～0.1363 mg/L之間。

表1 15種標準化合物的線性和靈敏度數(shù)據(jù)

表2說明了該HPLC-UV方法的準確度、回收率、精密度和重現(xiàn)性結(jié)果。準確性研究是為了檢驗通過分析方法獲得的實驗結(jié)果與真實值的接近程度。本研究在校準曲線范圍內(nèi)分析了每種標準化合物的三種不同濃度，分別為低、中和高濃度。注射一式三份。如表2所示，平均回收率在95.09%?106.22%范圍內(nèi)，相對標準偏差（RSD）小于5.62%。通過三種不同濃度（低、中、高水平）研究日內(nèi)（重復(fù)性）和日間（中等精密度）變化的精密度。為實現(xiàn)日內(nèi)精密度，在相同實驗條件下，在同一天進樣標準化合物溶液3次。保留時間的RSD值在0.00%～0.13%的范圍內(nèi)。對于峰面積，RSD在0.02%～5.62%之間變化。在相同的實驗條件下，在3個不同的日子里評估日間精密度。保留時間的RSD為0.00%～0.60%。對于峰面積，它在0.07%～4.41%的范圍內(nèi)。

表2 標準化合物的準確度和精密度數(shù)據(jù)

檸檬和酸橙精油中OHCs含量的比較

OHCs可用作某些柑橘物種的標志化合物。測量了檸檬和酸橙精油中OHCs的含量。表3說明了工業(yè)冷榨檸檬油和酸橙油之間OHCs的比較。石灰油中的OHCs含量比檸檬油高約10倍。如引言中所述，檸檬油中被認為不存在7-甲氧香豆素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯，但在檸檬油中鑒定出少量這三種化合物。由于檸檬油來自可靠的檸檬加工商，因此不同的砧木或檸檬雜交種可能是這三種化合物存在的原因。從表3中可以看出，檸檬油中7-甲氧香豆素、異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯的濃度遠低于酸橙油中的濃度。

表3 冷榨檸檬油和酸橙油中的OHCs

正品和摻假檸檬油樣品的揮發(fā)物和OHC含量比較

表4說明了通過GC-FID在檸檬油A和檸檬油X中鑒定出的揮發(fā)性化合物。不出所料，這兩種油的GC曲線以及數(shù)量（百分比）非常相似。主要成分是D-檸檬烯，兩個樣品的含量約為67%。其他單萜、倍半萜、醇和酯類無顯著差異。對傘草是檸檬油氧化的指示，檸檬油X（0.26%）遠高于檸檬油A（0.07%）。對傘花烯在典型冷榨檸檬油中的含量約為0.2%～0.5%。這兩種檸檬油在GC分析中的其他明顯差異是香茅醛和檸檬醛（香葉醛和香葉醛）。這些醛在檸檬油X中的含量低于檸檬油A。這些代表性醛的濃度仍在典型檸檬油的范圍內(nèi)。更重要的是，香葉酸和香葉酸之間的比例為0.61和0.66，這非常接近，并且與正宗檸檬油中的檸檬酸比例一致。因此，很難根據(jù)GC分析得出檸檬油X是否存在摻假的結(jié)論。

檸檬油A和檸檬油X中OHCs含量的比較在表5檸檬油X中發(fā)現(xiàn)的總OHC含量比檸檬油A低約34%。檸檬油X中的魚腥素、異山羊毛素和白藜蘆醇含量高得多，而其他OHC化合物與檸檬油A非常相似或更低，這表明檸檬油是與少量的石灰油混合，同時摻入蒸餾油或萜烯，使其更天然。從這個例子中，摻雜分析顯示，魚腥素，異山羊皮素，白藜蘆蘆醇和總OHC的含量可以被視為確定檸檬精油真?zhèn)蔚念A(yù)測因子。

表4 揮發(fā)性化合物比較

表5 OHCs比較

正宗檸檬油和市售檸檬油中主要OHCs化合物的分析

為了確定這4個預(yù)測因子對于檸檬油的真?zhèn)位驌郊倥袛嗍欠窨煽亢蜏蚀_，收集了124個正宗檸檬油樣品，從不同的香精香料公司收集了30個商業(yè)檸檬油樣品。表6列出了正宗檸檬油和市售檸檬油之間的OHCs含量比較。正宗檸檬油中的疝氣含量略低于商業(yè)油中的疝氣含量。正宗檸檬油中的異平寧和佛手柑烯濃度顯著較低，而正宗檸檬油中總主要OHCs含量遠高于商業(yè)檸檬油。

表6 來自正宗檸檬油和商業(yè)檸檬油的OHCs

為了進一步區(qū)分和分類不同檸檬精油的真?zhèn)位驌郊?，F(xiàn)SLR被用作探索性數(shù)據(jù)分析。四個建議的預(yù)測變量可以單獨使用，也可以一起用作預(yù)測二進制結(jié)果的變量。二元結(jié)果是正品或摻假檸檬油的概率。邏輯回歸計算給定多個預(yù)測變量中的單個結(jié)果（真實或摻假）的概率，如下所示：

其中，P（Yi）是Y是正宗或摻假檸檬油的預(yù)測概率；x是變量（預(yù)測變量）的觀測數(shù)；a和b是根據(jù)數(shù)據(jù)估計的系數(shù)；c是根據(jù)數(shù)據(jù)估計的常數(shù)。

在邏輯回歸中，使用稱為最大似然（ML）的基于微積分的函數(shù)來查找函數(shù)（系數(shù)和常數(shù)），該函數(shù)將最大限度地提高根據(jù)觀察到的x預(yù)測Y概率的能力。

表7顯示，在第1步中，總OHCs濃度是最有效的單個預(yù)測因子，其本身給出了92.9%的正確分類。在第2步中，通過添加異茴芹內(nèi)酯，這兩個預(yù)測因子共同實現(xiàn)了100.0%的準確率，對正宗或摻假的檸檬油進行分類。兩個步驟后，逐步邏輯回歸分析停止，因為添加其他預(yù)測變量無法進一步改進分類。表8顯示了每個單獨預(yù)測變量以及兩個組合預(yù)測變量的計算邏輯回歸結(jié)果和分類準確性。

表7 FSLR模型系數(shù)

表8 邏輯回歸計算結(jié)果和準確性

探索性分析后，使用Python3.10.4和Scikit-learn1.1.1通過5倍交叉驗證測試了邏輯回歸分類預(yù)測的性能。交叉驗證是一種重新采樣過程，用于評估機器學(xué)習(xí)模型在有限數(shù)據(jù)樣本量上的性能。對于5倍交叉驗證，所有數(shù)據(jù)樣本被洗牌并隨機分為5組。使用4組作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)來計算模型。最后一組作為測試數(shù)據(jù)，評價生成模型的分類精度。對于每組預(yù)測變量，此過程進行了5輪，以獲得平均準確率分數(shù)及其標準差。表9說明了從邏輯回歸到交叉驗證測試的所有可能的預(yù)測因子模型的性能。異茴芹內(nèi)酯和總OHCs的組合仍然是最佳預(yù)測因子，其準確率為98%，標準差為0.02。當(dāng)向該組合添加更多預(yù)測因子時，預(yù)測沒有改善，這與探索性分析的結(jié)果相同。因此，通過基于當(dāng)前檸檬油樣本池構(gòu)建的模型研究異麥角蛋白和總OHCs濃度來識別檸檬油的真?zhèn)问欠浅Ｓ星巴镜摹?/p>

表9 不同邏輯回歸模型的交叉驗證準確性提高了5倍

03

Conclusion

總之，數(shù)據(jù)和數(shù)學(xué)模型表明，OHCs可能是確定檸檬油真?zhèn)蔚挠行酥疚?。在這項研究中，通過HPLC-UV分析了154種檸檬油，然后利用獲得的數(shù)據(jù)構(gòu)建了邏輯回歸模型，以分離和鑒定檸檬油的真?zhèn)?。?jīng)過FSLR的分析，發(fā)現(xiàn)異茴芹內(nèi)酯和總OHCs濃度的組合是區(qū)分真?zhèn)魏蛽郊俚姆浅？深A(yù)測的標志物。此外，五重交叉驗證還證明，上述兩個預(yù)測因子能夠以98%或更高的準確率對真?zhèn)魏蛽郊龠M行分類。

與檸檬油的揮發(fā)物不同，OHCs餾分更難通過GC和GC/MS技術(shù)進行分析，但可以被視為解決摻假問題的巨大優(yōu)勢。本文研究的所有檸檬油樣品均通過行業(yè)規(guī)模加工并在美國市場流通，能夠代表當(dāng)前的市場質(zhì)量。由于工業(yè)樣品數(shù)量相當(dāng)多，本研究并未將特定化合物作為真?zhèn)未_定的標志物，而是旨在建立一個數(shù)學(xué)模型，其中包含OHCs的詳細分析數(shù)據(jù)。檸檬油是農(nóng)產(chǎn)品，由于嫁接技術(shù)不同或環(huán)境變化等各種因素，可能會發(fā)生一些成分變化，如果有新一批檸檬油經(jīng)過加工和分析，該模型中的數(shù)據(jù)集可以在每次更新。因此，所建立的模型可以作為一種方便、有用且具有高度可信度的工具，為工業(yè)QC在不久的將來通過有針對性且具有成本效益的HPLC-UV分析來識別檸檬油的真?zhèn)巍?/p>

Oxygen heterocyclic compounds (OHCs) in lemon oils are important markers in targeted HPLC analyses for authentication

Siyu Liua,*, Shiming Lib, Chi-Tang Hoa,*

a Department of Food Science, Rutgers University, New Brunswick 08901, USA

b College of Biology and Agricultural Resources, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China

*Corresponding author.

Abstract

Lemon oils are broadly used as flavoring agents in beverages, foods, cosmetics and pharmaceuticals, yet the adulteration of natural, particularly cold pressed lemon oils is very common in the industry due to its unmet demand and high cost. Nowadays, most quality control (QC) analysis of lemon oils is conducted by gas chromatography (GC) analysis, which is far from a reliable method. Oxygen heterocyclic compounds (OHCs) in non-volatile fraction are gaining increasing attention in authentication process because of the nearly finger-printing profiles of OHCs in cold pressed citrus essential oils. Our goal in this study was to identify OHCs using high performance liquid chromatography (HPLC) in lemon oils, establish OHC profiles, perform stepwise logistic regression analysis (SLRA) and build effective predicting model and further determine adulterated lemon oils by referencing the OHC profiles and established models. After HPLC analyses, profiling and SLRA modeling of 154 OHCs samples of industrial lemon oils, we found that the combination of isopimpinellin and total OHC concentration are essential and robust predictors to differentiate authentic samples from adulterated lemon oils with a success rate of 98% from the 5-fold cross validation. This study provided a reliable and efficient method in determining the authenticity of lemon oils.

Reference:

LIU S Y, LI S M, HO C T. Oxygen heterocyclic compounds (OHCs) in lemon oils are important markers in targeted HPLC analyses for authentication[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250027. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250027.

翻譯： 田雨欣（實習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

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