本期推薦的是由華北理工大學藥學院、河北省慢性疾病重點實驗室、河北工業(yè)大學健康科學與生物醫(yī)學工程學院等研究團隊合作近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示淫羊藿苷通過cGAS - STING通路減輕神經(jīng)炎癥從而緩解認知功能障礙。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Icariin alleviates cognitive dysfunction by reducing neuroinflammation via the cGAS-STING pathway

民族藥理學相關(guān)性
淫羊藿是一種中草藥，以其補腎功效而聞名。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有多種藥理特性，但其對阿爾茨海默病的影響尚需進一步探索。

研究目的
本研究旨在探討淫羊藿苷通過環(huán)狀GMP-AMP合成酶-干擾素基因刺激因子通路對阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥的抑制作用。

材料與方法
采用SPF級雄性ICR小鼠，通過側(cè)腦室注射Aβ1-42建立AD模型。通過行為學測試、病理學評估、免疫熒光染色、分子對接和蛋白質(zhì)印跡分析，評估ICA治療對小鼠記憶功能、神經(jīng)元損傷、神經(jīng)炎癥以及cGAS-STING通路的影響。

結(jié)果
ICA能顯著改善AD小鼠的記憶障礙，減輕神經(jīng)元損傷和細胞凋亡，并抑制神經(jīng)炎癥。此外，ICA抑制了小膠質(zhì)細胞的過度活化，促進了其從M1表型向M2表型的轉(zhuǎn)化。它特異性抑制了cGAS-STING通路的激活，并下調(diào)了cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-IRF3/IRF3和p-NF-κB/NF-κB的表達。此外，分子對接顯示，ICA與cGAS的結(jié)合能為-7.07 kcal/mol，表明兩者存在穩(wěn)定的相互作用。使用cGAS選擇性小分子抑制劑RU.521進行的進一步驗證，證實了ICA通過cGAS-STING信號通路對小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化和神經(jīng)炎癥的保護作用。

結(jié)論
ICA通過cGAS-STING通路抑制小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化和神經(jīng)炎癥，在AD中展現(xiàn)出治療潛力，使其成為靶向該通路的AD候選治療藥物。

圖文摘要

【前言】

阿爾茨海默?。ˋD）是一種進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要損害語言、記憶、認知和行為能力。AD的主要病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化產(chǎn)生的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為，Aβ寡聚體在神經(jīng)元突觸處的過度產(chǎn)生和聚集會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細胞凋亡以及隨后的神經(jīng)退行性變。目前可用的AD治療方法主要針對癥狀管理，無法改變疾病的根本進程。因此，迫切需要關(guān)注能夠預(yù)防或治療AD的藥物研發(fā)。

隨著對AD研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥是該疾病病理生理學的關(guān)鍵因素。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）主要的免疫細胞群，小膠質(zhì)細胞深度參與神經(jīng)炎癥過程，并負責清除神經(jīng)元周圍的細胞碎片和廢物。尤其重要的是，小膠質(zhì)細胞具有生物物理獨立性，它們參與CNS活動需要進行大量的結(jié)構(gòu)重塑。在神經(jīng)炎癥過程中，小膠質(zhì)細胞能夠感知環(huán)境變化并發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化，這對于其CNS功能至關(guān)重要。在健康的大腦中，小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)分枝狀形態(tài)，其特征是胞體小，具有眾多突起，包括適量的初級分支和廣泛分支的次級及三級突起，每個突起末端呈微小的錐形尖端。這些分枝狀的小膠質(zhì)細胞被認為是"靜息狀態(tài)"，在此期間，它們的分枝突起通過直接接觸或分泌介質(zhì)，持續(xù)不斷地與神經(jīng)元和其他膠質(zhì)細胞相互作用。當CNS受損時，小膠質(zhì)細胞被激活，伴隨著形態(tài)從靜息的分枝狀態(tài)向阿米巴狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。根據(jù)激活表型，小膠質(zhì)細胞可分為M1和M2表型。前者表現(xiàn)出細胞毒性，而后者則具有神經(jīng)保護特性。當M1型小膠質(zhì)細胞被激活時，會產(chǎn)生促炎細胞因子，如白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和活性氧（ROS）。在AD的病理過程中，Aβ和tau蛋白的特異性及過度磷酸化會觸發(fā)小膠質(zhì)細胞的M1型促炎反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡并產(chǎn)生關(guān)鍵炎性細胞因子。相反，M2樣反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞可以通過吞噬作用減輕Aβ和tau的積累。近期研究表明，通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)和神經(jīng)炎癥信號通路，可以改善包括AD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)后。

環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）通路構(gòu)成了一種關(guān)鍵的胞質(zhì)DNA感知機制，能夠觸發(fā)炎性細胞因子的產(chǎn)生，同時也參與誘導(dǎo)細胞凋亡。cGAS作為主要的胞質(zhì)DNA傳感器，能夠識別外源性和內(nèi)源性的異常雙鏈DNA（dsDNA）。識別后，cGAS發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，催化鳥苷三磷酸（GTP）和腺苷三磷酸（ATP）反應(yīng)，生成2‘3’-環(huán)狀GMP-AMP（cGAMP）。cGAMP作為第二信使，與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）上的銜接蛋白STING結(jié)合。當cGAMP與STING結(jié)合后，會引起構(gòu)象變化，使得STING更容易從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體進行激活。隨后，STING招募TANK結(jié)合激酶1（TBK1），從而啟動核因子κB（NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的轉(zhuǎn)錄通路。這一級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致炎性細胞因子和I型干擾素的釋放，從而加劇炎癥反應(yīng)、免疫失調(diào)和神經(jīng)元損失。值得注意的是，已有研究證實cGAS-STING通路在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生中起作用。先前研究已證明，cGAS-STING通路通過刺激小膠質(zhì)細胞并促進促炎細胞因子的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和認知障礙。因此，抑制cGAS以緩解神經(jīng)炎癥，成為AD一種潛在有效的治療策略。

淫羊藿是淫羊藿屬的一種被子植物。作為一種中草藥，其藥用價值在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有記載，并被廣泛認為具有補腎壯陽、強筋健骨以及祛風濕的功效。根據(jù)中醫(yī)理論，AD與腎虛、脾虛、氣血不足、痰濕阻絡(luò)、血瘀等因素有關(guān)，這與淫羊藿的傳統(tǒng)功效相吻合。淫羊藿苷（ICA）是從淫羊藿中提取的一種關(guān)鍵黃酮類化合物，具有穿過血腦屏障（BBB）的能力，并展現(xiàn)出多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)活性。研究表明，ICA對AD表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護作用，具體體現(xiàn)在減少β-淀粉樣蛋白沉積、改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、促進突觸可塑性、抑制神經(jīng)元凋亡以及緩解認知障礙。此外，ICA已被證明能有效減少脂多糖（LPS）在BV2細胞系中誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。然而，盡管ICA具有巨大的治療潛力，但仍需進一步的深入研究和驗證，以闡明其是否可能通過調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路來抑制神經(jīng)炎癥的具體機制。

在本研究中，我們初步評估了ICA對由Aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠模型的學習記憶能力和神經(jīng)炎癥的潛在益處。此外，我們研究了ICA對cGAS-STING通路的影響，并利用cGAS選擇性小分子抑制劑RU.521進一步驗證了ICA對cGAS-STING誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化所引發(fā)神經(jīng)炎癥的保護作用。這項研究表明ICA在治療AD方面可能具有潛力，從而為該領(lǐng)域未來的研究和開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

【結(jié)果部分】

1. ICA改善AD小鼠的學習記憶障礙

圖1. ICA對AD小鼠學習記憶能力的影響。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=12）。(A) 動物實驗設(shè)計時間線。該圖使用Biorender.com平臺創(chuàng)建，協(xié)議編號：QU27CAW222。(B) 各組小鼠的游泳軌跡。(C) 小鼠在Morris水迷宮中連續(xù)5天尋找隱藏平臺的平均潛伏期。(D) 空間探索試驗中穿越平臺的次數(shù)。(E) 空間探索試驗中小鼠在目標象限的探索時間。(F) 新物體識別實驗中的相對識別指數(shù)。(G) Y迷宮實驗中小鼠的自發(fā)交替率。

2.ICA減輕AD小鼠的神經(jīng)元損傷。

圖2. ICA對AD小鼠神經(jīng)元損傷的影響。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A，C）H&E染色的典型顯微照片，包括CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（A，H&E染色，400倍）；全海馬圖像完整顯示右側(cè)海馬組織，其中三個矩形框分別標示CA1、CA3和DG區(qū)域（C，H&E染色，100倍）。（B，D）尼氏染色的代表性圖像，包括CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（B，尼氏染色，400倍）；全海馬圖（D，尼氏染色，100倍）。（E）CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域尼氏小體的定量分析結(jié)果。

3.ICA減少AD小鼠的細胞凋亡。

圖3. ICA對AD小鼠細胞凋亡的影響。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A）TUNEL染色代表性圖片（TUNEL染色，200倍）。（B）海馬CA1、CA3和DG區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)量（C）Bcl-2和Bax的代表性蛋白條帶。（D）Bcl-2的標準化表達量。（E）Bax的標準化表達量。（F）Bcl-2/Bax比值。

4.ICA減輕AD小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活化。

圖4. ICA對AD小鼠神經(jīng)炎癥及小膠質(zhì)細胞活化的抑制作用。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A、B）促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）表達結(jié)果。（C、D）抗炎因子（IL-4和IL-10）表達結(jié)果。（E）Iba1免疫熒光染色代表性圖像（Iba1免疫熒光染色，200×）。（F）Iba1、CD16和Arg1蛋白的代表性條帶。（G）Iba1標準化表達量。（H）CD16標準化表達量。（I）Arg1標準化表達量。

5.ICA對cGAS-STING通路的影響。

圖5. ICA抑制AD小鼠cGAS-STING信號通路活化。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A）cGAS、STING、p-TBK1、TBK1、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IRF3和IRF3的代表性蛋白條帶。（B-F）cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65及p-IRF3/IRF3的標準化表達量。（G）ICA與cGAS分子對接實驗結(jié)果。

6.ICA高劑量通過抑制cGAS-STING通路減輕神經(jīng)炎癥。

圖6. ICA高劑量通過抑制cGAS-STING信號通路改善AD小鼠認知障礙和神經(jīng)元損傷。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（MWM實驗n=12，H&E和尼氏染色n=3）。(A) 各組小鼠游泳軌跡典型示意圖。(B) 小鼠在Morris水迷宮中連續(xù)5天尋找隱藏平臺的潛伏期。(C) 空間探索試驗中穿越平臺的次數(shù)。(D) 空間探索試驗中小鼠在目標象限的探索時間。(E) 海馬CA1、CA3、DG及皮層區(qū)域尼氏小體定量分析。(F) H&E染色典型顯微圖像，顯示CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（H&E染色，400倍）；全海馬圖像完整顯示右側(cè)海馬組織，三個矩形框分別標示CA1、CA3和DG區(qū)域（H&E染色，100倍）。(G) 尼氏染色代表性圖像，顯示CA1、CA3、DG和皮層區(qū)域（尼氏染色，400倍）；全海馬圖像（尼氏染色，100倍）。

圖7. ICA高劑量通過抑制cGAS-STING信號通路減輕AD小鼠神經(jīng)炎癥并抑制小膠質(zhì)細胞活化。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A、B）促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）表達結(jié)果。（C、D）抗炎因子（IL-4和IL-10）表達結(jié)果。（E）Iba1免疫熒光染色典型圖像（Iba1免疫熒光染色，200×）。（F）Iba1、CD16和Arg1蛋白的代表性條帶。（G）Iba1標準化表達量。（H）CD16標準化表達量。（I）Arg1標準化表達量。

圖8. ICA高劑量抑制AD小鼠cGAS-STING信號通路活化。數(shù)據(jù)以均值±標準差表示（n=3）。（A）cGAS、STING、p-TBK1、TBK1、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IRF3和IRF3的代表性蛋白條帶。（B-F）cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65及p-IRF3/IRF3的標準化表達量。（G,H）海馬區(qū)和皮層區(qū)域cGAS（紅色）與Iba1（綠色）雙重免疫熒光染色代表性圖像，細胞核經(jīng)DAPI（藍色）復(fù)染（cGAS與Iba1雙重免疫熒光染色，200×）。

7.機制圖。

【結(jié)論與討論】

阿爾茨海默病是一種與年齡相關(guān)的常見神經(jīng)退行性疾病，其中Aβ沉積和tau蛋白過度磷酸化是其病理生理學的關(guān)鍵指標。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，包括小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞在內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)炎癥的主要介導(dǎo)者，在神經(jīng)退行性疾病中具有至關(guān)重要的作用。越來越多的實驗證據(jù)表明，Aβ沉積會激活小膠質(zhì)細胞，從而啟動神經(jīng)炎癥，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和認知功能下降。cGAS-STING信號通路是一條經(jīng)典的炎癥通路。ICA是一類源自天然的異戊烯化黃酮類化合物，具有多種生物學效應(yīng)，如抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護特性。值得注意的是，研究表明ICA能增加小鼠CA3區(qū)的尼氏體數(shù)量，并增強AD小鼠模型的學習記憶能力。然而，ICA治療AD的潛在機制仍不明確。在本研究中，我們提供的證據(jù)表明，ICA能改善AD小鼠的病理變化并提高其認知功能。此外，我們觀察到AD小鼠腦中cGAS顯著升高，這與神經(jīng)炎癥有關(guān)。使用RU.521特異性抑制cGAS，通過抑制STING和NF-κB相關(guān)的炎性細胞因子，顯著減輕了炎癥反應(yīng)?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，ICA可通過調(diào)節(jié)cGAS-STING信號通路抑制神經(jīng)炎癥，從而改善認知功能障礙。

神經(jīng)炎癥在包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病中起著關(guān)鍵作用。在大腦中，cGAS-STING通路主要在小膠質(zhì)細胞中表達，并觸發(fā)干擾素反應(yīng)。小膠質(zhì)細胞激活后會產(chǎn)生神經(jīng)毒性物質(zhì)，最終導(dǎo)致腦損傷。實際上，小膠質(zhì)細胞在幾種神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出不同的表型并被激活。先前的研究將活化的小膠質(zhì)細胞分為M1和M2型以反映其功能多樣性。穩(wěn)態(tài)下的小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)高度分枝的形態(tài)，但激活后會發(fā)生諸如胞體增大、突起縮短等變化，并極化為M1或M2表型，以特定標記物為特征。由于多奈哌齊已被證明能有效減輕神經(jīng)炎癥和細胞凋亡，因此在本研究中被用作陽性對照藥物。我們的研究重點評估了小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)、形態(tài)以及炎癥因子表達。值得注意的是，在ICA治療組中，Iba1和CD16的表達顯著降低，而Arg1的表達則明顯增加。此外，ICA給藥導(dǎo)致小鼠腦組織中促炎細胞因子減少，而抗炎細胞因子增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，ICA能夠減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和小膠質(zhì)細胞活化，這與先前的文獻報道一致。此外，ICA對神經(jīng)炎癥的抑制作用可能歸因于其能夠抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化，同時促進其從M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化。另外，ICA能有效減少Aβ1-42引起的神經(jīng)元凋亡，這可能是由于其能夠阻止活化的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎性細胞因子。

外源性和異常定位的內(nèi)源性DNA可引發(fā)先天免疫反應(yīng)。先前研究已確定cGAS是一種主要識別胞質(zhì)DNA的關(guān)鍵模式識別受體。cGAS與胞質(zhì)DNA結(jié)合后被激活，并促進cGAMP的產(chǎn)生，隨后觸發(fā)STING及其下游效應(yīng)蛋白TBK1。這種激活級聯(lián)導(dǎo)致IRF3和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進而引發(fā)干擾素和炎癥基因的表達。越來越多的證據(jù)支持cGAS-STING通路在神經(jīng)退行性疾病的小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮作用。cGAS-STING通路能夠激活NF-κB依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這對于調(diào)節(jié)促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄以及包括細胞凋亡在內(nèi)的多種細胞生物學過程至關(guān)重要。細胞凋亡可通過外源性或內(nèi)源性途徑進行調(diào)節(jié)，其中內(nèi)源性途徑的激活與DNA損傷、缺血和氧化應(yīng)激等多種刺激密切相關(guān)。Bcl-2家族蛋白是內(nèi)源性凋亡的核心，其中Bcl-2維持細胞存活，而Bax則激活凋亡途徑。最近研究表明，STING可以激活NF-κB信號級聯(lián)，并且siRNA p65介導(dǎo)的NF-κB信號阻斷能顯著減少STING誘導(dǎo)的細胞凋亡和衰老，同時改善STING介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)代謝失衡。我們的結(jié)果表明，在Aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠腦組織中，cGAS、STING、p-TBK1/TBK1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IRF3/IRF3的表達水平均升高，而ICA干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這種升高。分子對接研究還發(fā)現(xiàn)ICA與cGAS之間存在顯著的結(jié)合親和力。小膠質(zhì)細胞在受到刺激后可以發(fā)生極化，采用促炎或抗炎表型。已發(fā)現(xiàn)cGAS-STING通路的異常激活與細胞凋亡有關(guān)。在我們的研究中，觀察到ICA通過抑制cGAS-STING通路來減輕神經(jīng)炎癥。這種抑制導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞的促炎極化減少，隨后炎性細胞因子的釋放也減少。通過緩解促炎微環(huán)境，ICA有助于減輕神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎癥環(huán)境。此外，這種抑制作用還降低了炎性介質(zhì)對神經(jīng)元的毒性作用，從而降低了神經(jīng)元凋亡的風險。值得注意的是，RU.521是一種有效的選擇性cGAS抑制劑，它通過血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護作用，并對神經(jīng)元凋亡、小膠質(zhì)細胞活化和小膠質(zhì)細胞形態(tài)變化產(chǎn)生有益影響。我們的結(jié)果顯示，單獨使用RU.521或RU.521聯(lián)合ICA-H治療的小鼠，上述蛋白的表達顯著降低，并且這些治療與單獨使用ICA-H相比無顯著差異。此外，cGAS和Iba1的共定位分析顯示，cGAS主要在海馬和皮層的小膠質(zhì)細胞中表達。這些數(shù)據(jù)突顯了ICA通過cGAS-STING通路減輕神經(jīng)炎癥，從而改善AD相關(guān)認知功能下降的潛力。

在本研究中，我們以神經(jīng)炎癥為重點考察了ICA的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，ICA能促進小膠質(zhì)細胞從M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化，從而減輕由小膠質(zhì)細胞過度活化引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。此外，ICA通過阻止cGAS-STING信號通路的激活來抑制炎性細胞因子的表達。值得注意的是，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，隨著cGAS-STING通路的激活，NF-κB的表達水平也同步增加。然而，我們的研究存在一些局限性。首先，經(jīng)典的STING-IRF3-I型干擾素通路在AD中的作用尚未完全闡明。其次，尚未評估這些通路在其他細胞類型中的調(diào)節(jié)潛力，因此值得進一步研究。最后，本研究觀察到ICA可能通過兩種協(xié)同機制發(fā)揮調(diào)節(jié)作用：ICA通過直接與cGAS結(jié)合來抑制其功能活性，從而阻斷cGAS-STING信號通路的激活；ICA可能通過促進cGAS蛋白降解或抑制其表達來降低細胞內(nèi)cGAS蛋白水平，從而從源頭上阻止通路激活。這兩種機制可能協(xié)同作用，共同構(gòu)成了ICA調(diào)節(jié)cGAS-STING通路的分子基礎(chǔ)。未來的實驗將進一步研究ICA降低cGAS蛋白水平的能力與其通過直接結(jié)合與cGAS蛋白相互作用的機制之間的關(guān)聯(lián)。

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