以聚苯乙烯納米塑料（PS-NPs）和鎘（Cd）單獨(dú)及聯(lián)合暴露為例探究對大腸桿菌生長及其作為食物源對秀麗隱桿線蟲生理與行為表型的影響。

實(shí)驗(yàn)處理組

1. 空白對照組（Ctr）

2. 聚苯乙烯納米塑料單獨(dú)暴露組（PS-NPs, 0.01 mg·L?1）

3. 鎘離子單獨(dú)暴露組（Cd, 0.5 mg·L?1）

4. PS-NPs與Cd復(fù)合暴露組（PS-NPs + Cd）

各暴露濃度依據(jù)環(huán)境中PS-NPs和Cd的實(shí)際檢出水平設(shè)定。所有處理均在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行。

大腸桿菌OP50生長曲線測定

將大腸桿菌OP50菌液以2%接種量加入各處理組的LB培養(yǎng)基中，充分混勻后置于37?°C、180 r·min?1搖床中振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、3、6、9和12小時(shí)后，使用紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm波長下測定菌懸液的吸光度（OD???），用于繪制生長曲線，評估PS-NPs和Cd對大腸桿菌增殖的影響。

暴露后大腸桿菌的收集與清洗

為確定最佳喂養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，分別在暴露0、3、6和12小時(shí)后收集各組大腸桿菌菌液（50 mL離心管，5,000 r·min?1離心10 min），棄去上清液。沉淀用無菌水洗滌3次，重懸后作為食物來源喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲。后續(xù)表型測試根據(jù)子代數(shù)量變化結(jié)果，選定最適暴露時(shí)長用于正式實(shí)驗(yàn)。

秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與同步化

秀麗隱桿線蟲在20?°C恒溫條件下，于NGM平板上培養(yǎng)，常規(guī)喂食大腸桿菌OP50。為獲得年齡同步的線蟲群體，采用NaClO/NaOH溶液裂解成熟成蟲以釋放卵，收集并孵化卵24小時(shí)，得到L1期幼蟲。

將同步化的L1期幼蟲轉(zhuǎn)移至預(yù)先鋪有經(jīng)上述處理的大腸桿菌的NGM平板上開始暴露處理，避光放置于20?°C恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。此后全程使用相應(yīng)處理的大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲，直至完成各項(xiàng)表型檢測。

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線蟲行為與生理表型評估

1. 頭部擺動(dòng)與身體彎曲頻率測定

取暴露后的成蟲，用M9緩沖液沖洗干凈，移至含100 μL M9緩沖液的新NGM平板上，靜置恢復(fù)1分鐘。記錄單條線蟲在20秒內(nèi)的：頭部擺動(dòng)次數(shù)：頭部從一側(cè)最大偏轉(zhuǎn)至另一側(cè)為一次；身體彎曲次數(shù)：身體沿長軸形成一個(gè)完整正弦波形為一次。每組檢測15條線蟲，獨(dú)立重復(fù)至少3次。

2. 咽泵運(yùn)動(dòng)頻率測定

將線蟲轉(zhuǎn)移至接種了正常OP50的NGM平板上爬行30分鐘以適應(yīng)環(huán)境，隨后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)其在20秒內(nèi)的咽部收縮次數(shù)（即咽泵運(yùn)動(dòng)）。每組記錄15條線蟲，重復(fù)≥3次。

3. 存活率與平均壽命測定

將同步化后的L1期幼蟲接種至各暴露體系中，在產(chǎn)卵期間每隔24小時(shí)更換一次平板，直至停止產(chǎn)卵。將首次產(chǎn)卵日定義為成蟲起始日（t = 0）。每日觀察并記錄線蟲存活狀態(tài)：用挑蟲針輕觸蟲體，若無任何運(yùn)動(dòng)反應(yīng)則判定為死亡。

存活率 = （總蟲數(shù)-死亡蟲數(shù)）/總蟲數(shù) × 100% ；平均壽命 = 所有線蟲存活時(shí)間之和/總蟲數(shù)，每組測試20條線蟲，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

4. 子代數(shù)目測定

從各處理組中隨機(jī)選取20條成蟲，單獨(dú)轉(zhuǎn)移至鋪有正常OP50的NGM平板上（每板1條蟲），定期更換平板以分離后代。統(tǒng)計(jì)每條線蟲在其生殖期內(nèi)產(chǎn)生的已孵化子代總數(shù)，取平均值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)不少于3次。

參考文獻(xiàn)：

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