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我們通常講的柱層析一般是指正相柱層析【】，柱子的填料是硅膠。硅膠表面有很多-SiOH基團(tuán)，因此對(duì)于大極性的化合物的吸附能力較強(qiáng)，柱層析洗脫時(shí)，硅膠對(duì)小極性的化合物吸附能力較弱，所以先被洗脫下來(lái)。對(duì)于一些極性超大的化合物，硅膠的吸附能力太強(qiáng)以至于用常用的溶劑無(wú)法洗脫下來(lái)，無(wú)法用正相柱層析進(jìn)行純化。

這種情況下就要考慮進(jìn)行反相柱層析，反相柱層析最常用的填料是C18反相硅膠填料，這類反相硅膠是利用C18烷基硅烷將硅膠的 -SiOH基團(tuán)封住，形成了很多C18鍵合微孔，對(duì)于小極性的化合物吸附能強(qiáng)，相反對(duì)大極性的化合物的吸附能力弱，因此和正相硅膠的洗脫順序相反，因此稱為反相硅膠。

我們?cè)谶M(jìn)行反相柱層析時(shí)，梯度洗脫開(kāi)始以大比例極性水溶液開(kāi)始， 由于 C18 反 相 硅 膠 填料 表面疏水性， 疏水官能團(tuán)就會(huì)發(fā)生蜷縮，因此使用前需要用極性有機(jī)溶劑活化（疏水官能團(tuán)得以舒展），再過(guò)渡到水溶劑（保持其吸附活性）。活化平衡的步驟必不可少，否則會(huì)明顯影響分離效率。

實(shí)驗(yàn)室中我們通常使用過(guò)柱機(jī)進(jìn)行反相柱層析，但是如果沒(méi)有過(guò)柱機(jī)，可以像正相一樣手動(dòng)柱層析嗎？當(dāng)然是可以的。區(qū)別就是C18填料有點(diǎn)貴，需要重復(fù)利用，別像普通硅膠一樣過(guò)完直接扔掉了。下面小編分享一下 加利福尼亞大學(xué)圣塔芭芭拉分校的C18反相柱層析標(biāo)準(zhǔn)操作。

這兩個(gè)化合物，含有羧基，酚羥基等大極性基團(tuán)，普通正相柱層析很難分離。反相TLC監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)分的很開(kāi)，適合反相柱層析。柱層析操作過(guò)程和正相柱層析大同小異。具體細(xì)節(jié)回看往期文章【】。

一、首先在柱子地下鋪一層1cm厚的石英砂。

二、裝入C18反相硅膠，甲醇潤(rùn)柱，活化硅膠，此步驟必不可少。

三、完全潤(rùn)濕硅膠后，上層留少量甲醇，輕輕敲擊，使填料上層更加平整。

四、平整后，將甲醇液面壓到硅膠上沿，上層加入2cm厚的沙子。

五、用過(guò)柱體系的水相置換柱子里的溶劑，準(zhǔn)備上樣。

一般情況下，濕法上樣就可以了，最好用水相體系溶解樣品進(jìn)行上樣，如果溶解度不好，可以加入少量的有機(jī)相促溶。上樣后，加入展開(kāi)劑梯度洗脫，加入溶劑時(shí)不要將上層的沙子沖散。注意事項(xiàng)：由于反相柱的壓力比普通的正相柱大很多，整個(gè)操作過(guò)程要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且加壓時(shí)將通風(fēng)櫥拉低，安全第一。梯度洗脫過(guò)程中，可以利用正相TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，如果爬不起來(lái)可以嘗試一下EA:AcOH=200:1體系。

六、柱層析結(jié)束后，利用甲醇沖洗柱子，下次備用。

常用的水相體系：0.1%TFA水溶液，0.1%碳酸氫銨水溶液。

有機(jī)相體系：乙腈，甲醇。

參考資料

C18 Reversed-Phase Silica Gel Flash Chromatography – A Visual Walkthrough；Jeffrey J. Jackson, Zakarian Group. UC Santa Barbara.