糖尿病腎?。―N）是由糖尿病引起的一種慢性腎臟疾病。目前，早期DN主要通過調(diào)節(jié)飲食、控制血糖等途徑延緩疾病進程，晚期患者主要采用透析和腎移植治療，這對患者及其家庭造成重大經(jīng)濟負擔。

熊果酸（UA）是一種存在于多種中藥、水果和蔬菜中的天然五環(huán)三萜化合物（圖1）。多種藥食同源的中藥中富含此成分，比如山楂、山茱萸等。UA廣泛的生物活性包括改善糖脂代謝紊亂、增強胰島素敏感性、抗炎抗氧化等，其在糖尿病、肥胖及非酒精性脂肪肝等疾病中已顯示出潛在治療價值。

新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院的顧惠賢、阿依夏木·麥提托合提、姚藍*等 擬建立高糖誘導小鼠足細胞的體外DN細胞模型，系統(tǒng)探討UA對高糖誘導的足細胞線粒體功能障礙、氧化應激及細胞凋亡的保護作用及可能的機制，以期為深入理解足細胞損傷的病理機制及UA防治DN的作用機制研究提供新的視角及理論依據(jù)，也為開發(fā)基于線粒體功能防治DN的新藥和藥食同源保健食品提供新的思路。

1 建立體外DN模型和確定給藥濃度

為了建立體外DN模型，本實驗采用CCK-8法檢測葡萄糖對足細胞增殖率的影響。如圖2A所示，隨著葡萄糖濃度增大，細胞增殖率先升高后降低；當葡萄糖濃度為200 mmol/L時，細胞增殖率約為80%，與對照組比較，顯著降低（

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2 UA改善HG誘導的足細胞線粒體形態(tài)異常

使用線粒體染料Mito-Tracker標記細胞中具有生物活性的線粒體為紅色熒光，以評估線粒體形態(tài)變化。正常生理狀態(tài)下，線粒體形態(tài)較為完整，多為規(guī)則的棒狀或橢圓形。由圖3可知，相較于CN組，HG組中出現(xiàn)線粒體形態(tài)異常，其形狀呈不規(guī)則且明顯碎片化，伴隨線粒體數(shù)量減少（

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3 UA抑制HG誘導的足細胞ROS產(chǎn)生

使用DCFH-DA評估HG誘導的足細胞中ROS的產(chǎn)生。DCFH-DA是一種可滲透性探針，可被ROS氧化而呈現(xiàn)綠色熒光。免疫熒光和流式細胞術(shù)的結(jié)果均顯示，相較于CN組，HG組中綠色熒光更強，說明細胞內(nèi)ROS水平異常升高（

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4 UA抑制HG誘導的足細胞mPTP的開放

使用熒光探針鈣黃綠素乙酰甲酯（Calcein AM）檢測HG誘導的足細胞中mPTP的開放程度。Calcein AM可對活細胞染色，通過被動運輸進入細胞并在細胞質(zhì)和線粒體中積累，并被水解為具有綠色熒光的鈣黃綠素。正常情況下，mPTP關閉，而CoCl2處理會猝滅細胞質(zhì)中的綠色熒光，僅保留線粒體內(nèi)的綠色熒光。細胞在氧化應激或Ca2＋超載刺激下，mPTP開放，鈣黃綠素從線粒體釋放至胞漿，與CoCl2結(jié)合使熒光猝滅；同時CoCl2進入線粒體進一步猝滅殘留熒光，導致線粒體熒光強度降低或消失。因此通過熒光強弱可反映mPTP的開放程度。由圖5可知，相較于CN組，HG組中線粒體mPTP開放程度顯著增加（

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5 UA改善HG誘導的足細胞MMP

JC-1是常用于MMP檢測的熒光探針。當MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物發(fā)出紅色熒光。相反，當MMP降低時，JC-1不能在線粒體基質(zhì)中聚集，此時JC-1為單體并產(chǎn)生綠色熒光。相較于CN組，HG組MMP顯著降低（

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6 UA改善HG誘導的足細胞凋亡

采用流式細胞術(shù)分析足細胞凋亡情況。如圖7所示，Annexin V-PI染色后，經(jīng)流式細胞術(shù)分析，HG組較CN組足細胞凋亡率顯著增加（

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7 UA對HG誘導的足細胞中CypD、VDAC、Bax、Bcl-2、Cyt c蛋白表達的影響

采用Western Blot方法分析足細胞中凋亡相關蛋白水平，如圖8所示。與CN組比較，HG組中Cyp D、VDAC蛋白水平顯著升高，證明高糖條件下，足細胞mPTP存在持續(xù)性開放；與HG組比較，UA給藥組中Cyp D和VDAC水平呈不同程度降低，僅高劑量組有顯著性差異（

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DN是一個全球性的健康問題，其病理特征和臨床表現(xiàn)復雜多樣。DN的組織病理學特征主要包括腎小球基底膜增厚、系膜細胞增生、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化以及足細胞損傷等。足細胞是不可增殖的終末分化細胞，其損傷會導致足突融合、足細胞數(shù)量減少以及腎小球濾過屏障功能受損。此外，足細胞損傷與氧化應激密切相關。氧化應激可以直接損傷足細胞結(jié)構(gòu)，或者通過激活凋亡信號通路、加劇炎癥反應，導致細胞凋亡、細胞焦亡、鐵死亡、壞死性凋亡等，這些病理變化導致腎功能改變，使臨床DN患者表現(xiàn)為GFR下降、肌酐升高、持續(xù)性蛋白尿、腎功能下降等。

線粒體作為細胞的動力源，同時也是產(chǎn)生ROS的主要場所，ROS主要包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧亞硝基陰離子等。長期高血糖環(huán)境下，細胞內(nèi)能量供應形式發(fā)生轉(zhuǎn)化，其表現(xiàn)為葡萄糖通過元醇途徑轉(zhuǎn)化為山梨醇和果糖，通過消耗細胞質(zhì)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和谷胱甘肽觸發(fā)氧化應激損傷。糖代謝異常引發(fā)晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）不斷累積，與腎臟中AGEs受體結(jié)合激活多種信號通路，導致足細胞中ROS過度產(chǎn)生。AGEs誘導的ROS增加不僅損傷足細胞結(jié)構(gòu)，還會通過激活NLRP3炎癥小體，誘導炎癥因子釋放，進一步加重足細胞損傷。此外，細胞線粒體產(chǎn)生ATP過程中，由于高糖的刺激導致電子傳遞鏈受損，使得過多的電子泄漏，與分子氧結(jié)合形成超氧化物（包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥自由基），ROS產(chǎn)生增多。過多的ROS積累而抗氧化防御機制的失衡，導致氧化應激水平升高，進而誘發(fā)足細胞凋亡。細胞中ROS的增加，一方面導致MMP喪失、線粒體形態(tài)碎片化，阻礙ATP生成和細胞能量代謝，進一步加劇ROS的生成及細胞氧化應激損傷。另一方面，線粒體功損傷又導致線粒體中過多Cyt c釋放，激活Caspase-3等凋亡相關蛋白，最終引發(fā)足細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導下足細胞ROS含量明顯高于對照組，說明高糖導致了足細胞氧化應激損傷，UA干預后ROS顯著減少，說明UA具備抗氧化的能力。CCK-8實驗及流式細胞實驗結(jié)果證實了UA能顯著改善HG誘導足細胞凋亡，且具有促進足細胞增殖的作用，但確切的作用機制有待于進一步研究。

研究表明，DN發(fā)病進程中，代謝紊亂引發(fā)的氧化應激導致線粒體功能障礙，參與足細胞凋亡過程。足細胞線粒體功能障礙表現(xiàn)為線粒體形態(tài)改變、MMP喪失、mPTP過度開放、ROS積累、ATP生成減少、線粒體DNA釋放等。線粒體是經(jīng)典的細胞程序性死亡執(zhí)行細胞器，線粒體介導的凋亡是通過mPTP過度開放實現(xiàn)的。mPTP是位于線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜之間的非特異性通道，由Cyp D和VDAC等關鍵蛋白組成。Cyp D是親環(huán)素家族中的一員，主要調(diào)節(jié)mPTP開放、線粒體鈣穩(wěn)態(tài)、線粒體能量代謝，參與細胞死亡進程。Cyp D通過調(diào)控mPTP的開放狀態(tài)，在細胞壞死和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。VDAC是一類位于線粒體外膜上的膜蛋白，其功能包括轉(zhuǎn)運代謝物和離子、維持線粒體穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細胞凋亡等。過量的ROS直接觸發(fā)mPTP異常開放，這允許分子質(zhì)量小于1.5 kDa的溶質(zhì)流入線粒體基質(zhì)，使線粒體膜通透性增加、線粒體腫脹、MMP去極化、線粒體膜間空間蛋白Cyt c釋放，相關凋亡因子（Bax、Bcl-2）被激活，最終結(jié)局為細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激下足細胞中線粒體形態(tài)異常，線粒體呈圓形且明顯碎片化，mPTP開放程度顯著增加，表明線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損；Cyp D和VDAC表達上調(diào)，意味著mPTP開放程度更強。UA能顯著恢復線粒體形態(tài)，抑制mPTP的異常開放及相關蛋白Cyp D和VDAC表達，說明UA可以恢復HG誘導下足細胞氧化應激觸發(fā)的線粒體功能障礙。MMP的去極化是線粒體功能障礙的關鍵指標之一，也是啟動細胞凋亡的關鍵步驟。MMP的穩(wěn)定是維持正常的細胞生理過程、維持線粒體氧化磷酸化以支持高效的ATP生產(chǎn)的關鍵因素。然而，當細胞受到各種應激刺激時，例如氧化應激、Ca 2＋ 過載、線粒體DNA損傷、藥物或化學物質(zhì)時，MMP發(fā)生去極化。MMP的去極化通過線粒體外膜透化過程觸發(fā)了關鍵的促凋亡因子Cyt c釋放到細胞質(zhì)中，Cyt c與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合形成凋亡小體。凋亡小體激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase-3。Caspase-3可切割多種細胞底物，是細胞凋亡的關鍵蛋白。Bcl-2和Bax是內(nèi)源性細胞凋亡的關鍵信號分子，分別發(fā)揮抗凋亡和促凋亡作用。當接收到凋亡刺激信號后二者易位至線粒體膜上并形成二聚體，進一步增加線粒體膜的通透性，進而激活Caspase級聯(lián)反應。故調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax之間的平衡是決定細胞命運的關鍵。此外，研究表明，Bcl-2蛋白能夠調(diào)控MMP，其阻止MMP去極化而保護細胞免于凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激下足細胞MMP去極化，說明線粒體功能受損；Bcl-2表達減少，Cyt c和Bax表達增多。UA干預恢復了MMP，逆轉(zhuǎn)凋亡蛋白的表達，說明UA可能通過恢復HG誘導足細胞mPTP過度開放及MMP，改善足細胞線粒體功能障礙，進而延緩足細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過體外實驗探討了UA對于高糖誘導的足細胞線粒體功能障礙及凋亡的影響。結(jié)果表明：UA能夠通過阻止足細胞氧化應激，改善足細胞線粒體功能障礙和細胞凋亡，延緩DN的發(fā)生發(fā)展。本研究為DN的治療途徑及對DN發(fā)病機制的認識提供了一種新的思路。靶向線粒體功能的系列藥物已在臨床中廣泛用于各種疾病的治療。例如：線粒體靶向抗氧化劑MitoQ可通過增強葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4易位和改善骨骼肌細胞線粒體功能障礙減輕胰島素抵抗進而改善肥胖；另一種線粒體靶向藥物SkQ1滴眼液已完成II期臨床試驗，其能顯著清除角膜細胞線粒體ROS，提高淚膜穩(wěn)定性改善干眼癥；Ebselen是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的新型抗炎藥，多項II期臨床試驗已證明其治療急性噪聲性聽力損失的安全性和有效性。近期研究發(fā)現(xiàn)Ebselen可能通過改善神經(jīng)膠質(zhì)細胞線粒體功能損傷，改善阿爾茨海默病患者的認知功能障礙。因此認為靶向線粒體可能成為治療DN的有效途徑之一。而本研究針對靶向足細胞線粒體功能改善作用的天然化合物UA防治DN的可能作用機制進行了初步的探索，為防治DN藥物篩選及疾病機制研究提供了可行的思路和方法。然而本研究基于體外細胞實驗展開，確切的作用仍有待于體內(nèi)實驗的進一步研究和驗證。

作者簡介

通信作者：

姚藍，博士、教授，碩士研究生導師中醫(yī)學院中藥藥理學教研室主任。主要從事中藥復方及新疆地產(chǎn)藥用資源藥理作用研究。主持國家自然科學基金1 項、自治區(qū)自然科學基金1 項、高校科研計劃項目1 項、主持產(chǎn)學研橫向課題2 項，在國內(nèi)核心期刊中發(fā)表論文69 篇，SCI論文5 篇。累積影響因子20 分，他人引用頻次654 次。2021年度獲“華夏醫(yī)學科技獎”，三等獎排名第六。2024年獲自治區(qū)科技進步一等獎排名第七。授權(quán)發(fā)明專利1 項、實用型新專利2 項。

第一作者：

顧惠賢，碩士研究生，研究方向為糖尿病及其并發(fā)癥藥理學。

本文《熊果酸改善高糖誘導的足細胞線粒體功能障礙的作用機制 》來源于《食品科學》2025年46卷第19期37-46頁，作者：顧惠賢，阿依夏木·麥提托合提，吳思宇，蔣祥龍，姚藍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250220-087。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。

實習編輯：王奕辰 ；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)。