凡納濱對(duì)蝦（

Litopenaeus vannamei

）營養(yǎng)物質(zhì)豐富、味道鮮美，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、養(yǎng)殖成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為全球養(yǎng)殖最廣泛的甲殼類水產(chǎn)品。食物過敏是指過敏患者接觸到特定食物后所表現(xiàn)出來的過敏性不良反應(yīng)，主要癥狀為鼻炎、蕁麻疹、腹瀉等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致過敏性休克甚至危及生命。研究表明，80%的蝦過敏都是由原肌球蛋白（TM）引起，其具有熱穩(wěn)定性，高溫處理難以改變其結(jié)構(gòu)，因此水產(chǎn)品在經(jīng)過常規(guī)烹制后仍可能具有很高的致敏性。

超聲（US）是一種新型非熱加工技術(shù)，可通過空化作用產(chǎn)生機(jī)械剪切和湍流效應(yīng)，同時(shí)形成局部瞬時(shí)高壓改變蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而降低蛋白致敏性，但對(duì)食物風(fēng)味及營養(yǎng)物質(zhì)破壞較小。高壓CO2（HPCD）是指在壓強(qiáng)低于50 MPa、溫度低于60 ℃的條件下，使CO 2 達(dá)到超臨界狀態(tài)的一種新型食品非熱加工方式。在HPCD處理過程中，CO 2 在高壓條件下溶于溶液使體系形成高壓酸性環(huán)境，在高壓、pH值和CO 2 分子效應(yīng)共同作用下實(shí)現(xiàn)殺菌、鈍酶和蛋白質(zhì)變性等目的，且HPCD處理?xiàng)l件溫和（溫度較低、隔絕氧氣），對(duì)食品的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特性影響較小。單一加工方式降低致敏性效果有限，通過兩種或多種加工方式聯(lián)合可更有效降低過敏原致敏性。

廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院的楊玉瑩、李言初、魏帥*等研究以凡納濱對(duì)蝦TM為對(duì)象，采用不同參數(shù)條件的USHPCD處理凡納濱對(duì)蝦TM，探究其對(duì)TM致敏性和構(gòu)象的影響，旨在為開發(fā)新型低敏食品提供新技術(shù)途徑。

1 US-HPCD處理對(duì)TM致敏性的影響

1.1 iELISA結(jié)果

采用US、HPCD、US-HPCD 3 種加工方式處理TM，iELISA結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，3 種加工方式均能顯著降低TM IgG/IgE免疫結(jié)合活性（

P

＜0.05），其中US-HPCD消減致敏性效果最佳，顯著優(yōu)于單獨(dú)US和HPCD處理（

P

＜0.05）。

采用不同US功率（0～2 000 W）處理TM 15 min，再采用HPCD處理，結(jié)果如圖2所示。功率為0 W即HPCD單獨(dú)處理，此時(shí)IgE和IgG的OD450 nm分別為0.84、1.19，與未處理組相比其IgE和IgG免疫結(jié)合活性分別降低8.9%、17.9%。這可能是因?yàn)樵贖PCD處理下，TM暴露在表面的致敏表位被破壞，導(dǎo)致致敏性下降。但是當(dāng)US功率為500 W時(shí)，包埋在TM內(nèi)部的致敏表位被暴露出來，此時(shí)TM致敏性反而增強(qiáng)；繼續(xù)增加US功率至1 500 W，與對(duì)照組相比，IgG和IgE的免疫結(jié)合活性分別降低28.7%、20.8%，可能是在US-HPCD的作用下部分致敏表位被掩埋；US功率增加到2 000 W時(shí)，TM IgE結(jié)合能力顯著升高，IgG結(jié)合能力無明顯變化，說明TM結(jié)構(gòu)重新達(dá)到一種穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)果表明，聯(lián)合處理過程中US功率的改變對(duì)TM致敏性有顯著影響，其中功率為500 W時(shí)，TM致敏性最強(qiáng)，1 500 W時(shí)致敏性最弱。

采用1 500 W功率US處理TM 0、5、15、30、60 min，再采用HPCD處理，結(jié)果如圖2所示。隨著US時(shí)間的延長，IgE和IgG免疫結(jié)合活性都呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。US處理30 min，再進(jìn)行HPCD處理后，與對(duì)照組相比，IgE和IgG的免疫結(jié)合活性分別消減了48.7%、55.3%；在US處理時(shí)間為60 min時(shí)，與對(duì)照組相比，TM IgE和IgG的免疫結(jié)合活性分別消減了48.6%、58.8%，與US處理30 min組相比，IgE結(jié)合能力無顯著變化，IgG結(jié)合能力降低。聯(lián)合處理過程中US時(shí)間延長降低了TM致敏性，綜合考慮時(shí)間因素，選用US處理30 min。綜上，US-HPCD聯(lián)合加工最佳工藝條件確定為US 1 500 W處理30 min，繼續(xù)HPCD 30 MPa處理15 min。

Zhang Ziye等采用US處理TM，發(fā)現(xiàn)有蛋白降解，從而降低了TM致敏性。Pang Lidong等采用US處理乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)其空間結(jié)構(gòu)的改變可能是造成致敏性降低的主要原因。Qiu Hui等采用HPCD處理小清蛋白，可降低致敏性39%～41%。Zhong Hangyu等研究發(fā)現(xiàn)US輔助低溫等離子處理對(duì)蝦TM會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化，從而導(dǎo)致IgE和IgG結(jié)合能力分別下降52.4%和46.5%。

1.2 TM免疫印跡結(jié)果

采用兔抗蝦TM多克隆抗體分析US-HPCD不同條件處理后TM的IgG結(jié)合能力，免疫印跡結(jié)果如圖3所示。采用不同US功率（0～2 000 W）處理TM 15 min，再采用HPCD處理，與對(duì)照組相比，處理后的TM條帶灰度明顯減少。US功率1 500 W時(shí)，TM出現(xiàn)降解（圖3A）。采用1 500 W功率US處理TM 0、5、15、30、60 min，再采用HPCD處理，US處理時(shí)間5 min時(shí)，TM主條帶降解產(chǎn)生了小片段；US處理30 min時(shí)，TM的IgG免疫結(jié)合活性明顯減弱（圖3B），這與iELISA測定結(jié)果相印證。

2 US-HPCD處理對(duì)TM結(jié)構(gòu)的影響

2.1SDS-PAGE分析

SDS-PAGE是評(píng)估蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布的常用手段，TM經(jīng)US-HPCD不同條件處理后，采用SDS-PAGE分析TM分子質(zhì)量的變化情況。如圖4所示，隨著US功率的增加和時(shí)間的延長，約在12、14、17 kDa處出現(xiàn)極淺的降解條帶。US功率1 500 W處理30 min時(shí)，主條帶寬度最窄，說明在加工的過程中蛋白發(fā)生聚沉形成難溶沉淀，降解條帶灰度隨之加深，說明US-HPCD可使TM發(fā)生降解。王新研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用HPCD處理TM會(huì)使條帶灰度變淺，但不會(huì)產(chǎn)生新條帶。Han Tinglu等發(fā)現(xiàn)隨著US時(shí)間的延長，TM條帶強(qiáng)度明顯減弱。US-HPCD會(huì)改變TM分子質(zhì)量，這可能是因?yàn)閁S的機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)以及HPCD所產(chǎn)生的CO2分子效應(yīng)使TM的肽鏈斷裂或重組，從而使蛋白分子質(zhì)量發(fā)生變化。因此，進(jìn)一步對(duì)US-HPCD處理后TM的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定分析，探究US-HPCD對(duì)TM結(jié)構(gòu)的影響。

2.2 圓二色光譜分析

利用圓二色光譜對(duì)TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，由圖5A1可知，未處理的TM在190 nm波長左右出現(xiàn)正峰，在222 nm和209 nm波長處出現(xiàn)雙負(fù)峰，說明TM為典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。經(jīng)過不同條件US-HPCD處理后，TM的圓二色光譜發(fā)生改變，使用CDNN軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)處理后TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生顯著變化（

P

＜0.05）（圖5A2）。

如圖5A2所示，隨著功率的增加，TM的

-螺旋含量先降低后升高，

-折疊、

-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量先增高后降低。當(dāng)US功率為1 500 W時(shí)，

-螺旋相對(duì)含量最低，由83.3%降低至56.8%，

-折疊相對(duì)含量由1.9%增高至10.0%，

-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量由9.2%增高至17.6%，無規(guī)卷曲相對(duì)含量由5.7%增高至15.7%。經(jīng)US功率1 500 W處理0～60 min，再采用HPCD處理，隨著US處理時(shí)間的延長，TM的

-螺旋含量降低，

-折疊和

-轉(zhuǎn)角含量升高，無規(guī)卷曲含量先升高后降低；當(dāng)US處理時(shí)間為30 min時(shí)，

-螺旋相對(duì)含量為42.7%，

-折疊、

-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對(duì)含量分別為14.9%、18.1%和24.3%，與US處理60 min組相比無明顯變化，但與未處理組相比存在顯著差異（圖5B2）。結(jié)果表明，在US-HPCD處理過程中，US功率和時(shí)間都能改變TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致

-螺旋含量降低，無規(guī)卷曲、

-折疊和 β -轉(zhuǎn)角含量呈現(xiàn)不同程度的增加，使TM由有序狀態(tài)向無序狀態(tài)轉(zhuǎn)化，分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，TM變得松散。US-HPCD處理使TM二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化可能是由US的空化作用和HPCD的CO2效應(yīng)共同作用所致。

戴澤川等探究高強(qiáng)度超聲對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲和

-螺旋向

-折疊和

-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變，與本研究結(jié)果不同，原因是其研究對(duì)象是蝦全蛋白，蝦TM的優(yōu)勢構(gòu)象是

-螺旋，而蝦全蛋白的優(yōu)勢構(gòu)象是

-折疊，因此二級(jí)結(jié)構(gòu)變化趨勢不同。Zhang Ziye等發(fā)現(xiàn)US處理可以使TM

-螺旋含量顯著降低，無規(guī)卷曲、

-折疊和

-轉(zhuǎn)角含量顯著增加。Qiu Hui等發(fā)現(xiàn)HPCD處理會(huì)使

-螺旋含量降低，無規(guī)卷曲、

-折疊和

-轉(zhuǎn)角含量呈現(xiàn)不同程度的增加，且致敏性有所下降。Cheng Junhu等發(fā)現(xiàn)隨著等離子體處理時(shí)間延長，

-螺旋含量下降，而

-折疊和無規(guī)卷曲的含量分別上升，致敏性下降。以上研究與本研究所得結(jié)論一致，

-螺旋結(jié)構(gòu)與TM致敏性相關(guān)，隨著

-螺旋含量的下降，TM致敏性也下降。

2.3 內(nèi)源性熒光光譜分析

內(nèi)源性熒光（天然熒光）是指蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸受到280 nm或295 nm波長的激發(fā)光會(huì)產(chǎn)生熒光，此熒光特性對(duì)微環(huán)境的改變很敏感，當(dāng)微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，熒光強(qiáng)度會(huì)隨之改變，從而反映出蛋白質(zhì)的構(gòu)象和三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。如圖6A所示，未處理組TM在332 nm波長處有最大吸收峰，在USHPCD處理過程中，隨著US功率的增加，熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)下降趨勢，說明在高強(qiáng)度的US處理過程中，TM的結(jié)構(gòu)逐漸展開。US功率為1 500 W時(shí)，熒光強(qiáng)度最小，與未處理組相比下降了49.8%，且最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移。US功率1 500 W處理0～60 min，再采用HPCD處理，隨著US處理時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢，表明TM結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了由折疊到伸展，再由伸展到折疊的動(dòng)態(tài)變化。在US時(shí)間為30 min時(shí)（圖6B），與未處理組相比下降了51.4%，且最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移（332 nm到310 nm）。綜上，說明US-HPCD處理改變了TM的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

Yang Wenhua等采用US預(yù)處理

-乳清蛋白，繼續(xù)進(jìn)行糖基化反應(yīng)，降低了其熒光強(qiáng)度，說明US產(chǎn)生的物理化學(xué)作用會(huì)促進(jìn)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。郭明慧等發(fā)現(xiàn)高密度CO 2 可以誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦肌球蛋白疏水基團(tuán)暴露，使蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)松散。Ekezie等發(fā)現(xiàn)隨著冷氬等離子體處理時(shí)間的延長，埋藏在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)部分暴露，導(dǎo)致疏水性增強(qiáng)。Wang Fengqi等發(fā)現(xiàn)低溫等離子體協(xié)同糖基化處理蝦TM使熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，說明協(xié)同處理使TM三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞更徹底。

2.4 紫外光譜分析

紫外光譜可表征小分子和蛋白質(zhì)之間的相互作用，可用于研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。紫外吸收光譜主要由側(cè)鏈上的色氨酸、酪氨酸，以及組氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸側(cè)鏈基團(tuán)決定，蛋白暴露的芳香族氨基酸越多，紫外吸收強(qiáng)度越強(qiáng)。如圖7所示，未處理組TM在265 nm波長左右有紫外特征吸收峰，說明它主要由其肽鏈上酪氨酸殘基的芳雜環(huán)π→π*躍遷引起。在US-HPCD處理過程中（圖7A），隨著US功率的增加，紫外吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在US功率為1 500 W時(shí)紫外吸收峰強(qiáng)度最大。經(jīng)US功率1 500 W處理0～60 min，再采用HPCD處理，隨著US處理時(shí)間的延長，紫外吸收峰強(qiáng)度也呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢，紫外吸收峰出現(xiàn)輕微的紅移（261 nm到264 nm）（圖7B）。特征吸收峰輕微紅移表明US-HPCD加工方法改變了TM所處的微環(huán)境，而紫外吸收峰強(qiáng)度增大可能是TM空間結(jié)構(gòu)展開或重聚，掩藏在蛋白內(nèi)部的芳香族氨基酸暴露所導(dǎo)致。

劉愛成等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過US處理，乳清蛋白紫外吸收光譜未發(fā)生偏移，紫外吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)。Qiu Hui等發(fā)現(xiàn)隨著HPCD處理?xiàng)l件的改變，紫外特征吸收峰未出現(xiàn)，紫外吸收峰強(qiáng)度增加。以上研究表明單獨(dú)使用US或者HPCD對(duì)蛋白進(jìn)行加工可能不會(huì)改變蛋白所處的微環(huán)境，但US-HPCD聯(lián)合對(duì)蛋白進(jìn)行加工，在US的剪切和空化作用及HPCD的CO2效應(yīng)和pH值共同作用下，TM的微環(huán)境可能發(fā)生極性變化，同時(shí)肽鍵可能也受到破壞，與SDSPAGE結(jié)果相印證。

2.5 游離氨基含量分析

鄰苯二甲醛可以與游離氨基反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物，在340 nm波長處有特征吸收峰，可用以表征蛋白結(jié)構(gòu)的展開程度。如圖8A所示，在US-HPCD處理過程中，隨著US功率的增加，游離氨基含量整體呈現(xiàn)減少的趨勢。在US功率為1 500 W時(shí)，與對(duì)照組相比游離氨基含量降低了12.08%；經(jīng)US功率1 500 W處理0～60 min，再采用HPCD處理，隨著US處理時(shí)間的延長，游離氨基含量呈現(xiàn)先減少后趨于平緩的趨勢（圖8B），在30 min時(shí)，與對(duì)照組相比游離氨基含量降低了21.82%，繼續(xù)延長時(shí)間游離氨基含量并無顯著變化（

P

＜0.05）。綜上，USHPCD處理可使TM空間構(gòu)象發(fā)生改變，當(dāng)處理?xiàng)l件為US在1 500 W處理30 min聯(lián)合HPCD 30 MPa處理15 min時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)展開程度最大，致敏性降低最多，與上述iELISA、蛋白印跡結(jié)果及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律相印證。

2.6 總巰基含量分析

總巰基包括暴露在蛋白質(zhì)表面的游離巰基和掩藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基。在功能基團(tuán)中，巰基尤為活躍，能夠反映蛋白聚集和展開過程中的交聯(lián)狀態(tài)，在結(jié)構(gòu)組成中占據(jù)重要位置。如圖9所示，與未處理組相比，US-HPCD不同處理?xiàng)l件下均可以使總巰基含量顯著下降（P＜0.05）。隨著US功率的增加，TM總巰基含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，當(dāng)US功率為1 500 W時(shí)，總巰基含量最低。經(jīng)US功率1 500 W處理0～60 min，再采用HPCD處理，隨著US處理時(shí)間的延長，TM總巰基含量呈現(xiàn)下降趨勢，在處理時(shí)間為30 min后，繼續(xù)延長時(shí)間對(duì)總巰基含量無顯著影響（

P

＜0.05）。在US-HPCD處理TM過程中，US處理會(huì)使水分子形成瞬態(tài)自由基，隨后交叉反應(yīng)生成過氧化氫，暴露的游離巰基會(huì)被過氧化氫不可逆地氧化為磺酸或亞磺酸，使總巰基含量下降。HPCD處理TM過程中，TM受到壓力和 CO 2 共同作用，空間結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基暴露，暴露的巰基被氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量減少。綜上，USHPCD處理可使TM的總巰基含量減少，當(dāng)1 500 W US處理30 min聯(lián)合HPCD處理時(shí)，巰基含量減少最顯著，繼續(xù)延長時(shí)間巰基含量無顯著變化，致敏性降低最多，這與前期二級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律結(jié)果相印證。

結(jié) 論

本研究探究不同參數(shù)條件下US-HPCD對(duì)凡納濱對(duì)蝦TM致敏性和空間構(gòu)象的影響。結(jié)果表明，US-HPCD（US 1 500 W，30 min；HPCD 30 MPa，15 min）可使TM IgG和IgE的免疫結(jié)合活性分別降低55.3%、48.7%。在此聯(lián)合處理下，TM二級(jí)結(jié)構(gòu)由有序變?yōu)闊o序，

-螺旋相對(duì)含量降低至42.7%，

-折疊、

-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量顯著增高；熒光光譜發(fā)生藍(lán)移，熒光強(qiáng)度減弱，紫外吸收峰發(fā)生紅移，紫外吸收強(qiáng)度增強(qiáng)；游離氨基和總巰基含量均降低。US-HPCD作為非熱加工方法之一，能有效降低TM致敏性，為開發(fā)低致敏性水產(chǎn)品提供了新途徑。

本文《超聲聯(lián)合高壓CO2處理對(duì)蝦原肌球蛋白結(jié)構(gòu)和致敏性的影響》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第16期295-303頁，作者：楊玉瑩，李言初，劉家彤，王澤富，韓宗元，劉書成，魏 帥 。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250110-083 。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：李杭生；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)