在受生物污染或生物武器攻擊的戰(zhàn)場(chǎng)上，越早檢測(cè)出生物戰(zhàn)劑的種類，越能快速適配治療方案，降低傷亡，直接關(guān)系部隊(duì)的戰(zhàn)斗力和人員安全。目前，國(guó)外相關(guān)領(lǐng)域的研究正將病原微生物檢測(cè)能力從實(shí)驗(yàn)室推向戰(zhàn)場(chǎng)前沿。

一、基礎(chǔ)研究方向

1.1從樣本到到答案(sample-to-answer)一體化系統(tǒng)

長(zhǎng)久以來(lái)，病原體快速檢測(cè)仍以PCR(鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng))技術(shù)為主，但其發(fā)展方向開(kāi)始從操作復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備轉(zhuǎn)向小型自動(dòng)化和低操作門(mén)檻的便攜式設(shè)備。

從樣本到到答案一體化系統(tǒng)的目標(biāo)是將樣本處理、核酸提取/富集、擴(kuò)增、檢測(cè)、判讀等一系列操作過(guò)程封裝在一次性密封耗材和一個(gè)小型儀器內(nèi)，操作者只需進(jìn)行極少的步驟，系統(tǒng)即可自動(dòng)給出定性或定量結(jié)果。

表.從樣本到到答案(sample-to-answer)一體化系統(tǒng)的組成

美國(guó)國(guó)防部自2017財(cái)年起開(kāi)始采購(gòu)由美國(guó)BioFire Defense公司研發(fā)的Film Array 2.0，該系統(tǒng)可檢測(cè)臨床樣本(血液、痰液等)和環(huán)境樣本(空氣、土壤和水)中的生物戰(zhàn)劑(炭疽、鼠疫、土拉弗雷熱、Q熱、埃博拉和馬爾堡病毒等)，任何人員(包括無(wú)技術(shù)背景的人員)可在2分鐘內(nèi)完成上樣，并在1小時(shí)內(nèi)出具檢測(cè)結(jié)果。

圖. Film Array 2.0系統(tǒng)

另一種被美軍廣泛使用的設(shè)備是美國(guó)Cepheid公司的GeneXpert系統(tǒng)。該系統(tǒng)具備多通道檢測(cè)能力，可在45分鐘內(nèi)出具結(jié)果。2022年，美軍與該公司簽訂了5.6億美元的合同用于相關(guān)設(shè)備的采購(gòu)。

圖. GeneXpert 4和GeneXpert 16系統(tǒng)

1.2 CRISPR分子診斷

CRISPR分子診斷(CRISPR-Dx)是基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的特異性核酸識(shí)別能力，利用Cas12/Cas13蛋白被靶序列激活后的“旁切活性”切割熒光報(bào)告分子，實(shí)現(xiàn)快速信號(hào)輸出。

相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，CRISPR分子診斷的特異性強(qiáng)、可擴(kuò)展性強(qiáng)、適用范圍廣、靈敏度極高，因此很適合用于新病原的檢測(cè)。然而其熒光報(bào)告強(qiáng)度和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)受溫度和樣本抑制等影響，因此整個(gè)反應(yīng)體系并不十分穩(wěn)定。

圖.幾種CRISPR分子診斷系統(tǒng)的原理

2022年，美國(guó)Sherlock Biosciences公司(CRISPR系統(tǒng)的發(fā)明者成立的公司)的產(chǎn)品便采用該技術(shù)，已通過(guò)FDA的審核用于新冠病毒的檢測(cè)，但是由于嚴(yán)格的質(zhì)量控制、批間一致性、干擾驗(yàn)證等因素，該試劑盒僅限于緊急情況下使用。

1.3宏基因組與第三代測(cè)序

宏基因組測(cè)序(mNGS)是一類非靶向的核酸檢測(cè)方法,通過(guò)對(duì)樣本中所有的核酸樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，再通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行識(shí)別，從而在一次檢測(cè)中同時(shí)覆蓋細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等多類微生物，并能在混合感染或非常規(guī)病原場(chǎng)景下提供額外檢出價(jià)值。

第三代測(cè)序是指長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序(long-read sequencing)，主要的技術(shù)平臺(tái)是納米孔測(cè)序(ONT)，可以實(shí)現(xiàn)邊測(cè)序邊分析，準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上，從樣本到初步結(jié)果的時(shí)間僅需數(shù)小時(shí)甚至更短。納米孔測(cè)序設(shè)備的尺寸十分小巧(通常只有手掌心大小)，可以直接連接到電腦，實(shí)時(shí)讀取檢測(cè)結(jié)果。

圖.納米孔測(cè)序原理(左圖)和設(shè)備(右圖)

1.4宿主反應(yīng)(host-response)

相比于前幾種技術(shù)，基于宿主反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)并不是檢測(cè)病原體本身，而是檢測(cè)人體在感染后產(chǎn)生的免疫-炎癥反應(yīng)模式，用這些反應(yīng)模式去判斷是否感染以及感染病原的類型、病情嚴(yán)重程度和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。它的優(yōu)勢(shì)在于，當(dāng)病原載量很低、取樣部位不理想或病原突變導(dǎo)致靶標(biāo)檢測(cè)漏檢時(shí)，宿主反應(yīng)仍可能給出“機(jī)體免疫系統(tǒng)已經(jīng)被病原激活”的信號(hào);同時(shí)還能在一定程度上區(qū)分感染與無(wú)菌炎癥，從而支持抗菌藥物的更精細(xì)決策。

目前，制約病原微生物快速檢測(cè)鑒定技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸是樣本的前處理，主要原因在于：

(1)低載量：在感染早期、用藥后或血流感染時(shí)樣本里病原體的含量較少，檢測(cè)難度高。

(2)強(qiáng)抑制物/復(fù)雜基質(zhì)：血液、痰液、糞便、土壤/污水里有會(huì)抑制擴(kuò)增/酶反應(yīng)或干擾傳感器讀數(shù)的成分。

(3)裂解與回收效率差異大：革蘭陽(yáng)性菌、分枝桿菌、真菌、芽孢、包膜病毒等難裂解的樣本會(huì)導(dǎo)致假陰性風(fēng)險(xiǎn)上升。

(4)富集和速度的矛盾：更靈敏的檢測(cè)技術(shù)往往要對(duì)樣本進(jìn)行富集和純化，但這會(huì)直接拖慢檢測(cè)速度。

二、美軍的相關(guān)研究項(xiàng)目

美國(guó)國(guó)防高級(jí)研究計(jì)劃局(DARPA)推動(dòng)了多個(gè)病原微生物檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)項(xiàng)目，包括利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)項(xiàng)目(DIGET)和表觀遺傳特征和觀察項(xiàng)目(ECHO)。

2.1 利用基因編輯技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)項(xiàng)目(DIGET)

DIGET項(xiàng)目由DARPA于2019年發(fā)起，項(xiàng)目周期4年(目前已完成)，依托CRISPR-Cas12/Cas13基因編輯技術(shù)，結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增、微流控、合成生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，目標(biāo)是解決美軍對(duì)快速、高可信度、可靈活適配的診斷與生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的迫切需求。對(duì)于該項(xiàng)目，美軍要求承包商交付2種產(chǎn)品：

(1)一次性即時(shí)診斷試劑盒，可檢測(cè)多達(dá)10種病原體和宿主生物標(biāo)志物。

(2)用于同時(shí)檢測(cè)1000個(gè)或更多樣本的可復(fù)用檢測(cè)設(shè)備。

表. DIGET項(xiàng)目的技術(shù)要求

2.2 表觀遺傳特征和觀察項(xiàng)目(ECHO)

ECHO項(xiàng)目于2018年發(fā)起，周期4年(目前已完成)，目標(biāo)是解決大規(guī)模殺傷性武器(WMD)及前體暴露檢測(cè)的痛點(diǎn)，即現(xiàn)有方法依賴殘留的生物痕跡(易消失、濃度低)，且需實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，無(wú)法在野外快速應(yīng)用。項(xiàng)目通過(guò)分析個(gè)人表觀基因組，和暴露后的持久分子印記，實(shí)現(xiàn)對(duì)WMD暴露的溯源與診斷，支撐軍事反恐及防擴(kuò)散任務(wù)。

該項(xiàng)目基于RNA-SEQ(基因表達(dá)分析)、ChIP-SEQ(組蛋白修飾檢測(cè))、WGBS(DNA甲基化分析)等分子生物學(xué)方法結(jié)合生物信息學(xué)工具和微流控技術(shù)，交付2種產(chǎn)品：

(1)ECHO特征檢測(cè)板：可檢測(cè)21種暴露特異性特征(4種必選生物制劑+17種自選類別，涵蓋化學(xué)、放射性、爆炸物等10類)，可區(qū)分暴露類型及暴露時(shí)間。

(2)便攜式集成檢測(cè)設(shè)備：集成樣本處理、表觀遺傳分析、結(jié)果解讀功能，適用于野外環(huán)境，無(wú)需專業(yè)操作人員。

表. ECHO項(xiàng)目的技術(shù)要求

三、總結(jié)

總體來(lái)看，國(guó)外病原體快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的共性特點(diǎn)與趨勢(shì)如下：

(1)速度和可適配并重：不僅追求分鐘級(jí)到小時(shí)級(jí)出結(jié)果，也強(qiáng)調(diào)新靶點(diǎn)快速上線與大通量檢測(cè)。

(2)從檢病原走向檢狀態(tài)：通過(guò)宿主反應(yīng)和表觀遺傳等方法，把檢測(cè)目標(biāo)從特定病原轉(zhuǎn)向機(jī)體狀體，提升檢測(cè)的廣譜性。

(3)面向戰(zhàn)場(chǎng)前沿：為滿足戰(zhàn)場(chǎng)的使用需求(檢測(cè)速度快，人員要求低)，檢測(cè)設(shè)備向小體積、低功耗、低操作難度、結(jié)果準(zhǔn)確、直觀易懂的方向發(fā)展。(來(lái)源：北京藍(lán)德信息科技有限公司)