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Introduction

克羅諾桿菌隸屬腸桿菌科，是一種食源性致病微生物。近年來，克羅諾桿菌被劃分為7 個種和3 個亞種，其中阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌是臨床的主要致病菌，可引起嬰幼兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎等嚴重疾病。嬰兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是其主要的污染途徑之一，加工環(huán)境是重要的污染源。因此，世界糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）將克羅諾桿菌屬列為PIF A類致病菌。由于克羅諾桿菌具有較強的環(huán)境適應(yīng)性，在全球乳制品行業(yè)中的污染事件不斷發(fā)生。因此，迫切需要對克羅諾桿菌的環(huán)境耐受性進行研究，分析其耐受性機制，為PIF及食品行業(yè)的安全保障奠定理論基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌可存在于各種干制品中，尤其是PIF，且污染范圍廣泛?？肆_諾桿菌比大多數(shù)腸桿菌科其他菌種具有更強的抗干燥和抗?jié)B透壓能力，使其能夠在極低水分活度的PIF中長期存活。且奶粉培養(yǎng)基中的克羅諾桿菌比緩沖液中的克羅諾桿菌具有更高的耐干燥性，這可能是由于牛奶中的某些蛋白質(zhì)和乳糖可以包裹克羅諾桿菌菌株，從而在干燥脅迫下保護細菌。

研究表明，在干燥條件下克羅諾桿菌可通過基因調(diào)控在細胞內(nèi)積累鉀離子、谷氨酸等電解質(zhì)，增加細胞內(nèi)滲透壓，從而適應(yīng)細胞外干燥條件造成的高滲透環(huán)境。此外，克羅諾桿菌可能通過積累海藻糖和甜菜堿等保護性多羥基化合物來增強其對干燥條件的抵抗力。另一種理論認為，能夠產(chǎn)生生物膜的克羅諾桿菌對干燥的抵抗力更強。近年來，一些與干燥和滲透耐受性相關(guān)的基因已被確定，但其抵抗干燥和滲透壓的機制還沒有得到充分的研究。

因此，寧波大學(xué)付世騫，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)楊鑫焱副教授和姜毓君教授等以分離自PIF的35株克羅諾桿菌為研究對象，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）進行菌種鑒定，并對所有菌株進行了耐干燥性和耐滲透性評價，同時分析了分離株的生物膜形成能力。進而分別選取兩種條件下最具代表性的菌株進行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘克羅諾桿菌在干燥和高滲透壓條件下的相關(guān)基因和調(diào)控途徑。

Results and Discussion

35 株分離株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與16S rRNA鑒定結(jié)果一致，表明MALDI-TOF MS鑒定能有效區(qū)分克羅諾桿菌屬。分離株所屬的阪崎克羅諾桿菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌（C. malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C. turicensis）和都柏林克羅諾桿菌（C. dublinensis）四個標(biāo)準菌株的質(zhì)譜如圖1a所示。其中，C. sakazakii和C. malonaticus的質(zhì)譜圖離子峰最為接近，離子質(zhì)荷比m/z在2 690、4 364、5 380、6 255、7 275、9 475和10 284附近均出現(xiàn)1 個離子峰，而C. malonaticus又在m/z 11 472和12 658附近各出現(xiàn)1 個離子峰。MALDI-TOF MS結(jié)果的聚類分析如圖1b所示，在參考了分離株所屬4 個種的標(biāo)準菌株的基礎(chǔ)上，克羅諾桿菌分離株被分為4 個大簇，屬內(nèi)不同種的菌株能夠被清晰地區(qū)分開，各個種內(nèi)不同的分離株也能夠進行有效的聚類和區(qū)分，說明MALDI-TOF MS分型的辨識度較高。

圖1 (a) 四株標(biāo)準菌株的質(zhì)譜圖；(b) 基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的克羅諾桿菌分離株聚類分析

菌株耐干燥情況如圖2a所示，不同克羅諾桿菌的耐干燥程度有所差異，受試分離株在相同干燥條件下的失活率在9.01%~77.57%。其中，干燥條件下具有較強耐受性的菌株為CS21（ST199）、CS19（ST83）、CS10（ST23）、CM3（ST7）和CS20（ST198），所對應(yīng)的致死率分別為9.01%、15.11%、20.12%、23.81%和24.75%。最不耐干燥的菌株為CS5（ST12）、CS15（ST50）和CM16（ST60），致死率均超過75%。經(jīng)統(tǒng)計，干燥失活率低于50%的克羅諾桿菌共有14 株，在50%~70%之間的克羅諾桿菌有16 株，其中參考菌株C. sakazakii ATCC 29544T的致死率為60.24%，唯一的1株C. dublinensis分離株的失活率為67.75%，均處于中等耐干燥水平。另外，有6 株克羅諾桿菌的干燥失活率超過70%。相比之下，上述在干燥條件下致死率較低的5 株克羅諾桿菌的耐干燥性更強。

耐滲透壓試驗結(jié)果表明，受試分離株均可在濃度為4%和6% NaCl的TSB液體培養(yǎng)基中生長，并且隨著鹽濃度的增加，菌株到達對數(shù)期和穩(wěn)定期的時間延長。因此，克羅諾桿菌可耐受的最高滲透壓條件為6% NaCl，所有菌株在此條件下的生長曲線如圖2b和2c所示。相比于參考菌株，部分C. sakazakii分離株生長速度較快，且達到穩(wěn)定期的菌體濃度較高，其中生長速度最快的菌株為CS8、CS14和CS7，生長速度次之但穩(wěn)定期菌體濃度較高的菌株為CS10和CS81，生長最慢的菌株為CS11。多數(shù)菌株在10~15 h達到對數(shù)期末期，仍有少數(shù)生長較慢的菌株在24 h仍未達到穩(wěn)定期（如CS2和CS11）。非C. sakazakii生長情況均不如標(biāo)準菌株。因此，耐滲透壓能力較好的菌株為CS7（ST17）、CS8（ST21）、CS10（ST23）、CS14（ST42）和CS81（ST260），均為C. sakazakii。

圖2 (a) 克羅諾桿菌分離株在干燥條件下的存活率；(b) C. sakazakii在含6% NaCl的TSB培養(yǎng)基中的生長曲線；(c) 非C. sakazakii在含6% NaCl的TSB培養(yǎng)基中的生長曲線

生物膜形成能力結(jié)果如圖3a所示，菌株CS17的生物膜形成能力最強，OD590 nm值為0.70；CS5的生物膜形成能力最弱，OD值僅為0.18。其中，有4 株菌株（CS20、CS10、CS21和CS14）的OD值處于0.5~0.7之間，生物膜形成能力僅次于CS17。有3 株菌株（CM24、CS32和CT23）的OD值處于0.3~0.5之間。多數(shù)菌株（25/36）的OD值分布在0.2~0.3之間，其中參考菌株的OD值為0.25，處于中等水平。有3 株菌株的OD值小于0.20，表明其生物膜形成能力較弱。研究表明，克羅諾桿菌的生物膜形成能力與菌株的耐干燥性有關(guān)，因此，將菌株的耐干燥性和生物膜形成能力分別由強到弱排列，得到兩者相關(guān)性如圖3b，多數(shù)耐干燥能力較強的菌株生物膜形成能力也較強，部分耐干燥能力較弱的菌株對應(yīng)的生物膜形成能力也偏低。說明生物膜對細菌的包被結(jié)構(gòu)對處在干燥脅迫環(huán)境下的細胞具有保護作用。

圖3 (a) 克羅諾桿菌的生物膜形成能力；(b) 克羅諾桿菌耐干燥性與生物膜形成能力的相關(guān)性

根據(jù)耐干燥和耐滲透試驗結(jié)果，篩選CS21和CS8作為代表性菌株，分別在干燥和高滲條件下進行轉(zhuǎn)錄組測序。對篩選出的差異表達基因進行KEGG富集分析，選擇富集最顯著的前20 條通路進行氣泡圖顯示。在干燥條件下（圖4a），信號通路可分為五大類，其中代謝類別數(shù)量最多，包含13 條信號通路和150 個差異表達基因，主要集中在碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、異種生物降解和代謝、能量代謝和氨基酸代謝過程。在高滲條件下（圖4b），信號通路分為六大類，代謝類別也最多，包含9 條信號通路和62 個差異表達基因，主要集中在氨基酸代謝、萜類和多酮類代謝、次生代謝物的生物合成、輔因子和維生素代謝、碳水化合物的合成和代謝、核苷酸代謝過程。根據(jù)干燥處理下RNA-seq分析結(jié)果，共篩選到56 個與耐干燥相關(guān)的基因，其中31 個基因差異表達。根據(jù)滲透壓力處理下RNA-seq分析結(jié)果，共篩選到66 個與耐滲透相關(guān)的基因，其中43 個基因差異表達。

對差異表達基因及其調(diào)控通路分析可知，在干燥和高滲條件下，克羅諾桿菌能夠活躍生物膜的合成作用，產(chǎn)生更多的海藻糖穩(wěn)定胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，積累甜菜堿保持細胞水分，同時積累鉀離子、鎂離子等電解質(zhì)，從而增加細胞內(nèi)滲透壓以抵抗干燥和高滲的脅迫作用。

圖4 KEGG通路富集分析 (a)干燥條件；(b)高滲條件

Conclusion

利用MALDI-TOF MS對35 株克羅諾桿菌進行了準確的鑒定和聚類分析。耐受試驗結(jié)果表明，分離株對于37 ℃、6 天的干燥條件的失活率在9.01%~77.57%，可耐受最高滲透壓條件為6% NaCl，且生物膜形成能力與耐干燥能力呈正相關(guān)。通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出31 個與耐干燥相關(guān)的差異表達基因和43 個與耐滲透壓相關(guān)的差異表達基因?？肆_諾桿菌在2 種處理條件下可以激活生物膜合成，產(chǎn)生更多海藻糖，積累甜菜堿和電解質(zhì)，穩(wěn)定胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。同時，首次發(fā)現(xiàn)cysM、thuF和ycjO等耐受相關(guān)基因。

01

第一作者簡介

付世騫，女，寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院講師，主要從事食品中有害微生物的檢測、溯源與控制。近五年，以第一作者或通訊作者發(fā)表學(xué)術(shù)論文9 篇（其中中科院一區(qū)Top期刊論文5 篇），參與申請發(fā)明專利8 項。主持象山縣科技計劃項目、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室開放基金和寧波大學(xué)教研項目各1項，參與國家級、省級和橫向課題10余項，獲全國高校食品科學(xué)與工程專業(yè)實驗教學(xué)案例三等獎。

02

通信作者簡介

楊鑫焱，女，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事乳品科學(xué)技術(shù)與質(zhì)量安全研究。近五年，以第一作者或通訊作者發(fā)表學(xué)術(shù)論文17篇，11篇為中科院一區(qū)Top期刊論文，3篇IF>10；授權(quán)發(fā)明專利5項；主持十四五國家重點研發(fā)計劃項目子課題，中國博士后面上資助，國家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)，黑龍江省重點研發(fā)計劃等國家級和省級項目6項。

姜毓君，男，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院二級教授、博士生導(dǎo)師，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)副校長、乳品科學(xué)教育部重點實驗室主任。入選長江學(xué)者特聘教授、國家“萬人計劃”領(lǐng)軍人才。榮獲全國食品安全工作先進個人、中國食品科技學(xué)會科技創(chuàng)新獎——突出貢獻獎。擔(dān)任國務(wù)院食品安全委員會專家委員會委員、中國營養(yǎng)保健食品協(xié)會副會長。主要從事乳制品、嬰幼兒配方食品和特醫(yī)食品等特殊食品和功能食品研究，先后承擔(dān)國家和省部級課題20余項。獲得省科技進步二等獎2項，中國和美國專利22件，主編或共同出版專著教材8部。以第一作者或通訊作者發(fā)表學(xué)術(shù)論文200余篇，其中多篇論文被選為封面文章。牽頭和參與多項國家食品質(zhì)量安全法規(guī)、標(biāo)準和技術(shù)規(guī)范的制定。

Desiccation and osmotic resistance mechanism of Cronobacter spp. isolated from powdered infant formula

Shiqian Fua, Danliangmin Songb, Xue Qinb, Lihan Wangb, Qianyu Zhaob, Chaoxin Manb, Xinyan Yangb,*, Yujun Jiangb,*

a Key Laboratory of Animal Protein Food Deep Processing Technology of Zhejiang Province, Zhejiang-Malaysia Joint Research Laboratory for Agricultural Product Processing and Nutrition, College of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315800, China

b Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Department of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

*Corresponding authors.

Abstract

Cronobacter spp. has strong resistance to desiccation and high permeability in Enterobacteriaceae, and powdered infant formula (PIF) is one of the main contamination routes. In recent years, the contamination of Cronobacter spp. in PIF incidents occurs from time to time, causing infant serious diseases or death. In this investigation, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry was used to identify the phenotypes of 35 Cronobacter strains isolated from PIF and its processing environment. Subsequently, the isolates were evaluated for drying and osmotic pressure tolerance. The results showed that the deactivation rate of the strains ranged from 9.01% to 77.57%, and the highest osmotic pressure condition the strains could tolerate was 6 g/100 mL NaCl. In addition, there was a positive correlation between biofilm formation ability and desiccation resistance. Combined with transcriptomics, Cronobacter spp. could activate biofilm synthesis, produce more trehalose, accumulate betaine and electrolytes to stabilize intracellular structure under the two treatment conditions. A total of 31 and 43 genes were found related to desiccation and permeability resistance, respectively. And some genes (cysM, thuF, ycjO, etc.) were found to be associated with two tolerances for the first time.

Reference:

FU S Q, SONG D L M, QIN X, et al. Desiccation and osmotic resistance mechanism of Cronobacter spp. isolated from powdered infant formula[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250063. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250063.

本文編譯內(nèi)容由作者提供

編輯：王佳紅；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意