口蹄疫病毒（FMDV）是嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展的動(dòng)物病毒，而劫持宿主翻譯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自身mRNA優(yōu)先翻譯則是病毒建立胞內(nèi)感染的關(guān)鍵步驟和限速環(huán)節(jié)，但其翻譯調(diào)控機(jī)制尚不明確。近期，本團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《Journal of Virology》的文章通過RNA親和捕捉法和RNA免疫共沉淀技術(shù)，結(jié)合互作組學(xué)分析和基因敲除等方法，系統(tǒng)解析了DDX5調(diào)控FMDV-IRES依賴性翻譯和基因組復(fù)制的分子機(jī)制，為深入理解病毒突破宿主翻譯限制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及開發(fā)靶向病毒-宿主互作的新型抗病毒策略提供了理論依據(jù)。

文章摘要

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）是許多病毒mRNA中的一種順式作用結(jié)構(gòu)元件，通過招募多種RNA結(jié)合蛋白及IRES反式作用因子（ITAFs）介導(dǎo)非帽依賴性翻譯?？谔阋卟《荆‵MDV）作為小核糖核酸病毒科的重要成員，其基因組包含功能性IRES元件，在病毒蛋白翻譯與RNA合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究揭示了一種此前未知的調(diào)控機(jī)制：DEAD-box RNA解旋酶5（DDX5）作為新型ITAF，通過兩種獨(dú)立策略抑制口蹄疫病毒的翻譯與RNA合成。首先，DDX5結(jié)合IRES的D4結(jié)構(gòu)域，通過阻斷80S核糖體組裝抑制IRES驅(qū)動(dòng)的病毒翻譯；其次，DDX5與病毒RNA依賴性RNA聚合酶3Dpol及病毒3′UTR相互作用，破壞病毒RNA合成過程。有趣的是，病毒前體蛋白3ABCD通過3Cpro介導(dǎo)的蛋白酶解作用可拮抗DDX5的抑制功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了DDX5在口蹄疫病毒致病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)深化了我們對(duì)病毒如何利用或拮抗宿主因子調(diào)控IRES驅(qū)動(dòng)翻譯的理解，為病毒感染過程中的翻譯控制機(jī)制提供了新視角。

結(jié)果展示

1.DDX5參與FMDV增殖

通過PK-15細(xì)胞感染FMDV發(fā)現(xiàn)，DDX5在mRNA水平上調(diào)但蛋白表達(dá)下降。敲低DDX5后，病毒RNA、結(jié)構(gòu)蛋白及病毒滴度均顯著升高，但不影響組裝與釋放，表明DDX5在FMDV復(fù)制過程中可能起到限制性作用(圖1)。

圖1 DDX5參與FMDV增殖

2.DDX5負(fù)向調(diào)控FMDV增殖

利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建DDX5敲除細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)DDX5缺失顯著促進(jìn)FMDV增殖，而過表達(dá)則抑制病毒復(fù)制。通過截短突變體功能分析，發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)DDX5具有抑制FMDV復(fù)制的完整能力，而僅包含N端DEAD盒、C端解旋酶結(jié)構(gòu)域或P68HR區(qū)域的結(jié)構(gòu)均無法單獨(dú)發(fā)揮作用，表明DDX5是FMDV復(fù)制的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，其完整結(jié)構(gòu)對(duì)其抗病毒功能至關(guān)重要(圖2)。

圖2 DDX5對(duì)FMDV的復(fù)制和增殖具有抑制作用

3.DDX5抑制FMDV-IRES依賴性翻譯

通過轉(zhuǎn)染FMDV亞基因組復(fù)制子RNA，發(fā)現(xiàn)DDX5敲除促進(jìn)EGFP表達(dá)，而過表達(dá)DDX5則抑制復(fù)制子活性，提示DDX5影響FMDV的翻譯和/或復(fù)制。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)，DDX5能特異性抑制FMDV和EMCV的 IRES翻譯，但對(duì)PV（I型）、CSFV（III型）和SVA（IV型）的IRES無影響。結(jié)果表明DDX5是FMDV IRES翻譯的負(fù)調(diào)控因子(圖3)。

圖3 DDX5是FMDV IRES翻譯的負(fù)調(diào)控因子

4.分析DDX5與FMDV-IRES和3’UTR相互作用

通過RNA互作實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DDX5可直接特異性結(jié)合FMDV RNA的IRES及3′UTR區(qū)域，其中IRES的D4結(jié)構(gòu)域是關(guān)鍵結(jié)合區(qū)。此外，激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示FMDV感染可誘導(dǎo)DDX5在感染后期（6小時(shí)）從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果表明，DDX5通過與病毒RNA關(guān)鍵區(qū)域直接互作，并在感染后發(fā)生亞細(xì)胞重定位，從而可能參與對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)控(圖4)。

圖 4 DDX5與FMDV-IRES和3’UTR相互作用

5.DDX5不直接調(diào)控FMDV mRNA翻譯起始

通過蔗糖密度梯度離心分析，發(fā)現(xiàn)FMDV感染會(huì)破壞宿主細(xì)胞的全局翻譯，誘導(dǎo)DDX5部分結(jié)合至40S核糖體亞基。并與eIF4G、PABP等翻譯起始因子互作，提示其可能參與調(diào)控FMDV IRES介導(dǎo)的翻譯起始。然而，DDX5敲低并不影響IRES對(duì)eIF2α、eIF3e等關(guān)鍵因子的招募，表明其不參與翻譯起始復(fù)合物的核心組裝，而更可能作為調(diào)節(jié)因子，在后續(xù)步驟（如60S亞基的加入）中發(fā)揮作用，從而干擾功能性80S核糖體的形成(圖5)。

圖 5 DDX5不影響FMDV IRES對(duì)關(guān)鍵起始因子的招募

6.DDX5干擾FMDV-IRES上的80S核糖體組裝

通過多聚核糖體圖譜分析發(fā)現(xiàn)DDX5抑制FMDV IRES依賴性翻譯。敲除DDX5使病毒mRNA向多聚核糖體區(qū)偏移并增加其豐度，而過表達(dá)則相反，表明DDX5特異性抑制病毒翻譯。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組DDX5蛋白能直接抑制80S核糖體組裝。上述結(jié)果表明，DDX5通過阻斷60S亞基與43S前起始復(fù)合物的結(jié)合，抑制功能性80S核糖體形成，從而負(fù)調(diào)控FMDV IRES翻譯(圖6)。

圖 6 DDX5不影響FMDV IRES對(duì)關(guān)鍵起始因子的招募

7、DDX5通過與口蹄疫病毒3D聚合酶相互作用抑制病毒RNA合成

使用CHX分離翻譯和RNA合成過程發(fā)現(xiàn)，DDX5敲除能直接增強(qiáng)FMDV RNA水平。DDX5可與病毒聚合酶3Dpol直接互作并共定位，其互作由病毒感染或3Dpro誘導(dǎo)。為排除DDX5對(duì)IRES翻譯的潛在影響，構(gòu)建了帽依賴性翻譯但復(fù)制缺陷的rFMDV-mCherry質(zhì)粒，以及IRES突變但復(fù)制能力完整的rFMDV-EGFP復(fù)制子，結(jié)果表明，在抑制新蛋白合成后，DDX5敲除仍能顯著促進(jìn)復(fù)制子RNA的積累(圖7)。

圖 7 DDX5與3Dpol互作抑制FMDV的RNA合成

8、口蹄疫病毒通過3ABCD蛋白酶前體拮抗DDX5介導(dǎo)的抑制

FMDV通過其前體蛋白3ABCD中的3C蛋白酶，特異性切割宿主DDX5蛋白第123位的谷氨酰胺（Gln-123），從而破壞其完整結(jié)構(gòu)。該切割不被經(jīng)典蛋白酶體、溶酶體或凋亡途徑抑制劑所抑制。切割產(chǎn)生的N端或C端片段均喪失抗病毒活性，證明該切割有效拮抗了DDX5對(duì)病毒復(fù)制的限制作用(圖8)。

圖 8 口蹄疫病毒通過3ABCD蛋白酶前體拮抗DDX5介導(dǎo)的抑制

9、DDX5敲降增強(qiáng)了小鼠對(duì)FMDV感染的易感性

在乳鼠體內(nèi)利用腺病毒載體敲低DDX5表達(dá)，探究其在FMDV感染中的功能。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，DDX5敲低組小鼠的多個(gè)組織DDX5蛋白水平顯著下降。在FMDV攻毒后，敲低組小鼠全部在4天內(nèi)死亡，而對(duì)照組在6天內(nèi)全部死亡。同時(shí)，敲低組肌肉組織的病毒載量較對(duì)照組高出約10^2.1倍。這些結(jié)果表明，DDX5的敲低增強(qiáng)了乳鼠對(duì)FMDV的易感性(圖9)。

圖 9 DDX5敲降增強(qiáng)了小鼠對(duì)FMDV感染的易感性

全文總結(jié)及科學(xué)意義

研究結(jié)論與意義：

本研究系統(tǒng)闡明了DDX5在口蹄疫病毒（FMDV）感染中的雙重作用與病毒拮抗機(jī)制。DDX5通過直接結(jié)合病毒IRES（尤其是D4區(qū)）和3′UTR，抑制IRES介導(dǎo)的翻譯（阻斷80S核糖體組裝）及病毒RNA合成（與3Dpol互作），從而負(fù)調(diào)控病毒復(fù)制。然而，F(xiàn)MDV通過其前體蛋白3ABCD中的3C蛋白酶切割DDX5第123位氨基酸，使其失活以拮抗宿主限制(見下圖)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低DDX5會(huì)加劇乳鼠的病毒感染與致死率?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)加深了對(duì)病毒如何利用或拮抗細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)IRES驅(qū)動(dòng)的翻譯的理解，并為病毒感染期間的翻譯控制提供了新的見解 。

該研究得到了甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（25JRRA1086、25JRA1089、24JRA804）和寧夏省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2024BF02017）的支持。的資助。郭慧琛研究員為論文通訊作者，博士研究生吳金恩為第一作者。