羅丹明B（RB）是一種人工合成染料，常用于紡織業(yè)、制藥工業(yè)和生物分析化學(xué)領(lǐng)域。RB對(duì)人和動(dòng)物的致癌性、生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性和慢性毒性已被許多研究證明。然而，由于RB具有鮮艷的顏色特性和較強(qiáng)的染色穩(wěn)定性，且價(jià)格便宜，一些不法商家為了增強(qiáng)和保持食品外觀，吸引消費(fèi)者，將其非法用于食品中，特別是辣椒粉、辣椒油、醬料等中，給消費(fèi)者的飲食安全帶來了極大的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來，一些新的納米材料如熒光微球、量子點(diǎn)，時(shí)間分辨熒光微球等逐步應(yīng)用到免疫層析法中，以提高其檢測(cè)靈敏度，其中時(shí)間分辨熒光微球是含有大量鑭系熒光材料的功能微球，具有熒光強(qiáng)度大、壽命長(zhǎng)、斯托克斯位移大等獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)，能有效消除基質(zhì)中各種背景熒光干擾，與膠體金、普通熒光微球和量子點(diǎn)熒光免疫層析法相比，時(shí)間分辨熒光免疫層析（TRFICA）法具有檢出限（LOD）低、線性范圍寬、抗原及抗體用量少、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，目前已成為食品中有害小分子化合物定量分析的一個(gè)焦點(diǎn)研究方向，并被廣泛報(bào)道，然而其能否應(yīng)用于RB的檢測(cè)目前鮮見相關(guān)報(bào)道。RB是一種熒光物質(zhì)，在水溶液中最大發(fā)射波長(zhǎng)為576 nm，但其熒光壽命極短，不到3 ns，而時(shí)間分辨熒光信號(hào)的收集時(shí)間范圍是400～800 μs，在此范圍內(nèi)RB產(chǎn)生的熒光已完全衰減，因此，采用TRFICA實(shí)現(xiàn)對(duì)RB的檢測(cè)在理論上是可行的。

棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院的王照鵬*、 高馨妍、劉瀟晴 等人結(jié)合時(shí)間分辨熒光標(biāo)記技術(shù)和側(cè)流免疫層析技術(shù)，初步探討TRFICA應(yīng)用于RB檢測(cè)的可行性。通過優(yōu)化熒光探針的標(biāo)記條件、試紙條包被和反應(yīng)條件、樣品預(yù)處理等，建立調(diào)味品中RB的TRFICA方法，旨在為食品中非食用色素的監(jiān)管提供新的檢測(cè)工具。

1

TRFICA檢測(cè)機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建方法基于競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析原理，樣品溶液中的RB與NC膜上包被的RB-BSA抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合探針抗體。如圖2所示，將標(biāo)記好的探針和樣品溶液加入到微孔中，孵育后用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品溶液無RB時(shí)，探針被T線包被的RB-BSA抗原捕獲，在紫外光下可形成明亮的熒光線，此時(shí)為陰性；若樣品溶液含有RB時(shí)，則與T線上的RB-BSA抗原競(jìng)爭(zhēng)探針，減少探針與RB-BSA抗原的結(jié)合，導(dǎo)致T線的熒光減弱或消失，此時(shí)為陽性。樣品溶液中RB越多，T線處的熒光強(qiáng)度越弱。無論樣品中是否含有RB，探針均會(huì)與C線預(yù)先包被的二抗結(jié)合，在紫外光下出現(xiàn)一條熒光線，即質(zhì)控線。

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試紙條反應(yīng)條件的優(yōu)化

影響抗原抗體反應(yīng)的因素包括抗原和抗體濃度、反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間等，本研究采用單因素分析法對(duì)抗原包被量、探針抗體標(biāo)記量、試紙條反應(yīng)pH值等試紙條反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

NC膜上的包被抗原與樣品中目標(biāo)物分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合熒光探針上的抗體，抗原包被量過多將抑制探針抗體和樣品中目標(biāo)物的結(jié)合，產(chǎn)生低靈敏度信號(hào)。選擇1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL 4 個(gè)RB-BSA抗原質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，如圖3a所示，試紙條包被抗原質(zhì)量濃度越高，雖然T線熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)，但抑制率也隨之升高，當(dāng)抗原質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，抑制率最低，故作為最佳抗原包被量。

探針抗體標(biāo)記量能顯著影響檢測(cè)試紙條熒光信號(hào)強(qiáng)度和抑制率?？贵w標(biāo)記量過大將使熒光探針上抗體過飽和，需要更高濃度的RB才能抑制探針和T線抗原的結(jié)合，造成檢測(cè)靈敏度下降。選擇anti-RB mAb標(biāo)記量（anti-RB mAb與熒光微球料液比）分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，如圖3b所示，當(dāng)抗體標(biāo)記量越大，試紙條T線熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，抑制率出現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)抗體標(biāo)記量為0.4 mg/mL熒光微球時(shí)，抑制率最低，故作為熒光微球最佳抗體標(biāo)記量。

pH值可誘導(dǎo)抗體分子發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，這可能破壞與抗原的互補(bǔ)性，影響抗原抗體結(jié)合。對(duì)樣品稀釋液的pH值進(jìn)行優(yōu)化，如圖3c所示，試紙條在不同pH值條件下T線熒光強(qiáng)度和抑制率均出現(xiàn)明顯差異，當(dāng)pH值為7.4時(shí)，試紙條抑制率最低，故確定的試紙條反應(yīng)的最佳pH值為7.4。

表面活性劑在側(cè)流免疫層析中能降低表面張力，促進(jìn)側(cè)向流動(dòng)過程，并促進(jìn)免疫探針在試紙條上的擴(kuò)散，減少非特異性吸附，進(jìn)而影響試紙條顯色和抑制率。本實(shí)驗(yàn)比較了吐溫-20、吐溫-80、曲拉通X-100和S9 4 種表面活性劑對(duì)試紙條T線顯色和抑制率的影響，如圖3d所示，當(dāng)使用曲拉通X-100和S9作為表面活性劑時(shí)，試紙條T線顯色較弱且抑制較差，當(dāng)使用吐溫-20和吐溫-80時(shí)，兩者熒光強(qiáng)度相當(dāng)，但吐溫-20抑制率更低，故選擇吐溫-20作為試紙條反應(yīng)最佳表面活性劑。

有機(jī)溶劑濃度過高可降低抗體生物活性，影響與抗原的結(jié)合。因樣品預(yù)處理使用的提取劑為體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液，故需確定試紙條的最高乙醇耐受量，以確定樣品提取液的稀釋倍數(shù)。如圖3e所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%～20%時(shí)，試紙條的T線顯色和抑制率相差不明顯，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%時(shí)，試紙條顯色明顯變?nèi)?，探針在NC膜底端出現(xiàn)明顯聚集，推測(cè)過高的乙醇含量可能影響了探針在NC膜上的遷移，并影響了探針和抗原的結(jié)合，造成試紙條顯色減弱和抑制率升高。雖然試紙條最高可耐受體積分?jǐn)?shù)20%乙醇溶液，但乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，抑制率相對(duì)更低，故選擇體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液作為試紙條反應(yīng)的最佳乙醇耐受量。

熒光探針用量能顯著影響試紙條T線熒光強(qiáng)度，使T/C值改變，進(jìn)而影響抑制率。如圖3f所示，隨著熒光探針用量的增加，試紙條T線熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，抑制率出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)熒光探針用量為4 μL時(shí)，抑制率最低，故選擇4 μL作為試紙條反應(yīng)的最佳探針用量。

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試紙條層析時(shí)間的確定

試紙條層析時(shí)間過短情況下，反應(yīng)難以達(dá)到平衡，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性，層析時(shí)間過長(zhǎng)，則會(huì)降低檢測(cè)效率。如圖4所示，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，C線和T線熒光強(qiáng)度不斷產(chǎn)生變化，T/C值也不斷變化，但反應(yīng)17 min后，T/C值基本趨于穩(wěn)定，說明反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，故確定試紙條的反應(yīng)時(shí)間為17 min。綜合以上條件，能夠確定試紙條的檢測(cè)步驟：1）取4 μL熒光探針加入微孔中，加入50 μL 1.3.5節(jié)稀釋后的樣品提取液，混勻，室溫孵育3 min；2）取40 μL上述混合物加到試紙條樣品墊上，層析反應(yīng)17 min后，用熒光免疫分析儀讀數(shù)；3）將樣品的T/C值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中RB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

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樣品預(yù)處理?xiàng)l件確定

因RB在水和乙醇中具有高溶解性，分別選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為樣品提取劑。如圖5所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，試紙條抑制率也逐漸升高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)抑制率最低，故選擇40%乙醇溶液作為樣品提取劑。

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標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在不含RB的辣椒粉、辣椒油和番茄醬空白樣本中添加RB標(biāo)準(zhǔn)品，梯度含量分別為0、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/kg，用試紙條進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)梯度重復(fù)3 次，取其平均值，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以T/C值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得的10%抑制濃度（10% inhibition concentration，IC10）作為L(zhǎng)OD，以IC20～I(xiàn)C80作為其線性范圍，確定本方法對(duì)辣椒粉的LOD為1.9 μg/kg，IC50為8.7 μg/kg，線性范圍為3.4～22.4 μg/kg（圖6a）；對(duì)辣椒油的LOD為0.7 μg/kg，IC50為4.6 μg/kg，線性范圍為1.4～14.8 μg/kg（圖6b）；對(duì)番茄醬的LOD為1.5 μg/kg，IC50為5.4 μg/kg，線性范圍為2.4～11.8 μg/kg（圖6c）。

6

方法的特異性評(píng)價(jià)

在痕量物質(zhì)檢測(cè)中，為評(píng)價(jià)方法對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的高度特異性和靈敏性，宜采用低濃度目標(biāo)物和高濃度類似物進(jìn)行分析。在方法特異性評(píng)價(jià)中，分別對(duì)質(zhì)量濃度為5 μg/L的RB和質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL的羅丹明110、羅丹明123、羅丹明6G、結(jié)晶紫、對(duì)位紅、胭脂紅等10 種色素用試紙條進(jìn)行了檢測(cè)，并用樣品稀釋液作陰性對(duì)照。如圖7所示，用試紙條檢測(cè)高質(zhì)量濃度的羅丹明110、羅丹明123、羅丹明6G、結(jié)晶紫、對(duì)位紅、胭脂紅等色素時(shí)，其顯色強(qiáng)度及T/C值與陰性對(duì)照差異不大，而檢測(cè)低質(zhì)量濃度的RB時(shí)其顯色強(qiáng)度及T/C值下降明顯，表明試紙條對(duì)于RB有高度特異性，而對(duì)其他色素均無明顯反應(yīng)，說明本方法特異性良好。

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方法的準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別獲得對(duì)辣椒粉、辣椒油、番茄醬3 種樣本的線性范圍，在線性范圍內(nèi)選取高、中、低3 個(gè)梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)LC-MS/MS確證過的陰性樣本做添加回收實(shí)驗(yàn)。每個(gè)梯度質(zhì)量分?jǐn)?shù)做6 個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均回收率和批內(nèi)變異，用3 個(gè)批次試紙條對(duì)同一批樣本進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批間變異。如表1所示，辣椒粉、辣椒油、番茄醬3 種樣本中RB平均添加回收率范圍為87.0%～106.1%，批內(nèi)變異系數(shù)為5.4%～11.2%，批間變異系數(shù)為6.4%～11.6%。表明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

近年來調(diào)味品中RB非法添加報(bào)道常見于辣椒及其制品、番茄醬等商品中，本研究選擇辣椒粉、辣椒油和番茄醬3 種調(diào)味品作為研究對(duì)象，考慮到不同調(diào)味品可能產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)，故擬合了不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別用于辣椒粉、辣椒油和番茄醬中的RB檢測(cè)，從添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，表明本方法具有較好的樣本適應(yīng)性，具有推廣應(yīng)用到其他類型調(diào)味品的潛力。

8

儀器方法確證

從市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)辣椒粉、辣椒油和番茄醬樣品各3 份，用LC-MS/MS檢測(cè)后均為陰性。在樣品中分別添加RB梯度含量為5、10、20 μg/kg，同時(shí)用TRFICA法和LC-MS/MS法進(jìn)行分析，如圖8所示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有高度相關(guān)性（R2＝0.941 3），說明本方法檢測(cè)結(jié)果可靠，可用于調(diào)味品中RB的快速篩查。

9

與其他方法的比較

TRFICA與已有檢測(cè)方法的比較如表2所示。UPLCMS/MS法等雖然具有較高的靈敏度，但需要大型昂貴儀器和專業(yè)技術(shù)人員、成本高、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不宜作為快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。紫外-可見分光光度法需要將樣品中RB濃縮后才可實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)，靈敏度較低。電化學(xué)分析法雖然較為靈敏，但易受樣品中電活性物質(zhì)干擾，樣品預(yù)處理較為復(fù)雜，導(dǎo)致分析時(shí)間延長(zhǎng)。表面增強(qiáng)拉曼光譜分析方法雖然檢測(cè)快速，但對(duì)基底親和力要求高，對(duì)基質(zhì)干擾敏感，其靈敏度有待進(jìn)一步提高。ELISA方法雖然靈敏，但需要多次孵育和洗滌，操作過程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足快速檢測(cè)需求。目前研究報(bào)道的免疫層析法主要是膠體金法，該法雖然操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，但膠體金納米粒子亮度低、靈敏度較差。本研究建立的TRFICA方法具有LOD低、檢測(cè)時(shí)間短、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、回收率高的特點(diǎn)，無論在靈敏度上還是檢測(cè)效率上，都具有一定優(yōu)勢(shì)，且檢測(cè)設(shè)備方便攜帶，能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求，是對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充。

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結(jié) 論

目前對(duì)食品中RB的快速檢測(cè)方法報(bào)道較少，本研究基于時(shí)間分辨熒光標(biāo)記技術(shù)和側(cè)流免疫層析技術(shù)，開發(fā)了RB的TRFICA法，可用于調(diào)味品中RB的快速定量檢測(cè)。本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單，待檢樣本經(jīng)一步提取后即可通過試紙條實(shí)現(xiàn)對(duì)RB的檢測(cè)，結(jié)果可在17 min內(nèi)獲得，其在辣椒粉、辣椒油和番茄醬中LOD分別為1.9、0.7、1.5 μg/kg，均低于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法SN/T 2430—2010（LOD：5 μg/kg）。通過特異性實(shí)驗(yàn)、添加回收實(shí)驗(yàn)可知，本研究所構(gòu)建方法具有良好的特異性、準(zhǔn)確度和精密度。通過儀器確證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性和可靠性，表明本方法可用于調(diào)味品中RB的快速篩查。本研究初步探討了時(shí)間分辨熒光標(biāo)記技術(shù)和側(cè)流免疫層析技術(shù)在RB檢測(cè)應(yīng)用上的可行性，可為RB熒光定量試紙條的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，但研究還存在著不同調(diào)味品類型標(biāo)準(zhǔn)曲線不統(tǒng)一、檢測(cè)靈敏度需進(jìn)一步提高、設(shè)備智能化水平不高等問題，開展系統(tǒng)的樣品預(yù)處理方法研究，開發(fā)信號(hào)更強(qiáng)的標(biāo)記物，探索機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能在檢測(cè)體系中的應(yīng)用研究是解決上述問題的未來發(fā)展方向。

作者簡(jiǎn)介

通信作者：

王照鵬 講師

棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院

2009年7月至2014年8月在北京維德維康生物技術(shù)有限公司從事食品中有害物質(zhì)快速檢測(cè)產(chǎn)品研發(fā)工作，2014-2018年在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)攻讀博士學(xué)位，2018年6月博士畢業(yè)并到棗莊學(xué)院工作，主要研究方向?yàn)槭称分形：ξ锟焖贆z測(cè)技術(shù)。 主持山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目1 項(xiàng)，參與國(guó)家級(jí)和省市級(jí)科研課題多項(xiàng)，在Food Chemistry，Journal of Food Composition and Analysis，F(xiàn)ood Analytical Methods等食品類專業(yè)期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文多篇，參與申請(qǐng)并獲授權(quán)專利１０余項(xiàng)。

引文格式：

王照鵬, 高馨妍, 劉瀟晴, 等. 利用時(shí)間分辨熒光免疫層析法測(cè)定調(diào)味品中的羅丹明B[J]. 食品科學(xué), 2026, 47(2): 1-9. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250822-159.

WANG Zhaopeng, GAO Xinyan, LIU Xiaoqing, et al. Determination of rhodamine B in condiments by time-resolved fluorescence immunochromatography[J]. Food Science, 2026, 47(2): 1-9. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250822-159.

實(shí)習(xí)編輯：楊倩；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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