福州大學汪少蕓教授團隊在國際權(quán)威期刊《Food Chemistry》發(fā)表題為《New insights into the cryoprotective mechanism of antifreeze peptides for surimi: Dual regulation of ice crystals and myosin》的研究論文。該研究以真鯛（Evynnis japonica）魚鱗為原料，通過酶解制備得到魚鱗源抗凍肽（Ej-AFP），系統(tǒng)揭示了其在凍融循環(huán)中對魚糜肌球蛋白的多尺度保護機制。Ej-AFP通過抑制冰晶重結(jié)晶與直接穩(wěn)定肌球蛋白構(gòu)象的雙重調(diào)控，在2%低濃度下即展現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)8%蔗糖-山梨醇復(fù)合物的冷凍保護效果，為開發(fā)新型天然、低糖、高效冷凍保護劑提供了重要理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

研究背景

冷凍保藏是魚糜及其制品加工和貯運中最常用的方法，可有效抑制微生物生長和酶活性，延長貨架期。然而，在冷凍過程中，溫度波動、反復(fù)凍融會導(dǎo)致冰晶重結(jié)晶，引起蛋白質(zhì)局部脫水、離子濃度變化和氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致肌球蛋白變性、聚集，使魚糜凝膠性能下降、持水性降低、質(zhì)地劣化。

傳統(tǒng)商業(yè)冷凍保護劑（如4%蔗糖+4%山梨醇）雖能有效抑制蛋白變性，但存在甜度高、熱量高、掩蓋海鮮風味等缺陷，不符合當前消費者對低糖、天然健康食品的需求。因此，開發(fā)低糖、天然、安全的新型冷凍保護劑成為研究熱點。

抗凍肽因分子量小、溶解性好、易于消化吸收、與食品體系相容性高等優(yōu)點，成為替代傳統(tǒng)冷凍保護劑的理想候選。然而，其與肌球蛋白的相互作用機制及多尺度保護效應(yīng)尚未完全闡明。

研究結(jié)果 1. Ej-AFP的氨基酸組成：富含Gly/Pro，賦予結(jié)構(gòu)靈活性與抗氧化潛力

團隊從真鯛魚鱗中通過酶解制備得到Ej-AFP（平均分子量1.21 kDa，純度94.96%），氨基酸組成分析顯示其富含Gly（25.77%）、Ala（13.62%）、Glu（12.95%）、Pro（11.62%）。Gly和Pro賦予肽鏈骨架靈活性和β-轉(zhuǎn)角傾向，有助于肽段與冰晶或蛋白質(zhì)表面的結(jié)合；Glu/Asp等酸性殘基提供極性羧基，可形成氫鍵和靜電相互作用；疏水殘基（Ala、Phe）則通過范德華力/π-π堆積穩(wěn)定界面結(jié)合。這種平衡的氨基酸組成使Ej-AFP兼具冰晶結(jié)合能力和蛋白質(zhì)界面穩(wěn)定能力。

2. Ej-AFP抑制凍融誘導(dǎo)的肌球蛋白氧化損傷

• 維持Ca2?-ATP酶活性：經(jīng)4次凍融循環(huán)后，對照組Ca2?-ATP酶活性僅剩37.44%，而Ej-AFP處理組保留60.01%~76.90%，其中2% Ej-AFP組達76.90%，優(yōu)于8%商業(yè)冷凍保護劑，表明Ej-AFP有效保護了肌球蛋白頭部活性中心。

• 降低羰基含量：對照組羰基含量升高至初始的500.57%，而2% Ej-AFP組僅升高至295.70%，抑制效果與8%商業(yè)冷凍保護劑相當，證實Ej-AFP可有效清除活性氧，防止蛋白質(zhì)羰基化。

• 保護總巰基，抑制二硫鍵形成：4次凍融后，對照組總巰基降至69.17%，二硫鍵升至153.30%；2% Ej-AFP組總巰基保留79.51%，二硫鍵僅升至135.72%，表明Ej-AFP可屏蔽氧化敏感的半胱氨酸殘基，防止不可逆交聯(lián)。

• zeta電位：2% Ej-AFP組在4次凍融后仍保持最高zeta電位（4.89±0.18），靜電排斥力最強，有效防止蛋白聚集。

• 粒徑：對照組粒徑由462.1 nm增至672.8 nm，而2% Ej-AFP組僅由380.7 nm增至423.2 nm，聚集程度最低。

• 溶解度與濁度：2% Ej-AFP組溶解度從93.94%降至90.74%，濁度僅從0.18升至0.22，顯著優(yōu)于對照組（溶解度71.18%，濁度0.61），證實Ej-AFP可有效抑制凍融誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)沉淀和聚集。

• 紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜：對照組r值（反映芳香族殘基微環(huán)境）從1.2578降至1.0650，表明色氨酸/酪氨酸發(fā)生聚集掩埋；而2% Ej-AFP組r值從1.2789升至1.3403，微環(huán)境更穩(wěn)定。

• 內(nèi)源熒光光譜：4次凍融后，對照組熒光強度下降21.1%，而2% Ej-AFP組僅下降4.5%，證明Ej-AFP有效保護了色氨酸的疏水環(huán)境。

• ATR-FTIR二級結(jié)構(gòu)分析：對照組α-螺旋含量從28.3%降至25.2%，無規(guī)卷曲從18.6%增至27.4%；2% Ej-AFP組α-螺旋僅降至26.7%，無規(guī)卷曲僅增至23.2%，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性顯著優(yōu)于商業(yè)冷凍保護劑。

• 掃描電鏡（SEM）顯示，新鮮魚糜凝膠呈現(xiàn)致密均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；4次凍融后，對照組凝膠孔洞增大、網(wǎng)絡(luò)塌陷，而2% Ej-AFP組仍保持相對致密的結(jié)構(gòu)，與8%商業(yè)冷凍保護劑組相當。

• 冰晶重結(jié)晶抑制實驗：在-6℃退火30 min后，對照組冰晶尺寸分布寬泛（100-1000 μm2，62.56%在此范圍），而Ej-AFP組79.04%的冰晶尺寸小于800 μm2，且晶體形態(tài)圓潤，可均勻分散機械應(yīng)力，避免對肌球蛋白網(wǎng)絡(luò)的破壞。

通過同源建模構(gòu)建了海鱸肌球蛋白重鏈結(jié)構(gòu)（模板1KK8，Ramachandran圖顯示85.4%殘基在最適區(qū)域，模型可靠）。選取Ej-AFP中具有代表性的三條肽段（IYAFP、GGAFP、NKAFP）進行分子對接：

• GGAFP和NKAFP能穩(wěn)定結(jié)合于肌球蛋白頭部區(qū)域，主要通過氫鍵、鹽橋、范德華力以及與Lys、His等堿性殘基的相互作用。脂肪族殘基（Ile、Leu、Val）與肌球蛋白疏水域形成烷基鏈相互作用，芳香殘基與Trp側(cè)鏈形成π-π堆積，從而穩(wěn)定肌球蛋白疏水核心，防止氧化降解。

• 表面作用力分析證實，GGAFP/NKAFP與肌球蛋白之間形成了廣泛的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和疏水相互作用，增強了肌球蛋白的空間剛性。

• IYAFP未能與肌球蛋白形成穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)象，提示其主要通過冰晶界面發(fā)揮作用，而非直接結(jié)合肌球蛋白。

這些結(jié)果表明，Ej-AFP中的GGAFP和NKAFP是關(guān)鍵的活性肽段，通過直接結(jié)合肌球蛋白，發(fā)揮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用；同時，Ej-AFP整體還通過抑制冰晶重結(jié)晶，提供多尺度保護。

圖文鑒賞

Fig. 1. Effects of Ej-AFP on oxidation of myosin during freeze-thaw cycles: (A) Ca2+-ATPase activity; (B) Carbonyl content; (C) Total sulfhydryl content; (D) Disulfide bond content.

Fig. 2. Effects of Ej-AFP on aggregation of myosin during freeze-thaw cycles: (A) Zeta potential; (B) Particle size; (C) Solubility; (D) Turbidity.

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.147495

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