2026年3月，北京大學(xué)趙揚(yáng)研究組在干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域知名期刊Cell Stem Cell上發(fā)表了題為“Perturb-seq uncovers pathological obstacles to direct cardiac reprogramming in vivo” 的研究論文。在這項(xiàng)研究中，研究者建立了一套專(zhuān)為研究在體微環(huán)境特異調(diào)控因子而設(shè)計(jì)的在體細(xì)胞命運(yùn)擾動(dòng)圖譜構(gòu)建方案，繪制了心梗區(qū)域“在體重編程”誘導(dǎo)心肌再生的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化圖譜，并從140個(gè)候選因子中鎖定了首要障礙因子——鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin, CALR）。研究發(fā)現(xiàn)，心梗區(qū)域的應(yīng)激響應(yīng)激活CALR的表達(dá)，使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量駐留Ca2+，降低胞質(zhì)鈣濃度和鈣信號(hào)活性，進(jìn)而抑制了關(guān)鍵重編程因子MEF2C的活性。通過(guò)抑制CALR或激活鈣離子信號(hào)活性能顯著提升心肌重編程效率和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的質(zhì)量。Calr敲低促進(jìn)心梗后的在體重編程效率，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)，為心梗的再生醫(yī)療提供了理論基礎(chǔ)和有轉(zhuǎn)化前景的新靶點(diǎn)。

圖1. 基于細(xì)胞移植的在體Perturb-seq揭示“在體重編程”首要障礙因子CALR

心肌梗死是全球主要死亡原因之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)患者生命造成重大威脅。由于成年哺乳動(dòng)物心臟的再生能力極其有限，心梗區(qū)域的心肌因缺血壞死后取而代之的是心臟纖維化等病理過(guò)程。利用重編程因子將心梗區(qū)激活態(tài)心臟成纖維細(xì)胞“在體”原位誘導(dǎo)成為功能性心肌細(xì)胞，有望同時(shí)抑制心臟纖維化及實(shí)現(xiàn)心肌高效再生，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的夢(mèng)想。然而，“在體重編程”較之培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)重編程的難度更大。趙揚(yáng)研究組近年來(lái)深耕“在體重編程”的調(diào)控，報(bào)道了一系列可以提高心梗區(qū)激活成纖維細(xì)胞重編程效率的新因子和小分子，和周斌研究組合作利用嚴(yán)格的譜系示蹤系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)觀(guān)測(cè)和驗(yàn)證（Circulation, 2023; iScience, 2023; Front Cell Dev Biol, 2020）；以及進(jìn)一步揭示心梗微環(huán)境中免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞）及心臟纖維化相關(guān)因子等調(diào)控在體重編程的分子機(jī)制（Protein & Cell, 2024; Life Medicine, 2026）。然而，復(fù)雜的病理微環(huán)境因素仍像一道道無(wú)形的屏障使得在體重編程仍遠(yuǎn)達(dá)不到體外重編程的效果；而傳統(tǒng)的研究方法也只能先逐一提出候選因子假設(shè)，再依次開(kāi)展基于譜系示蹤體系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；每個(gè)候選因子的在體研究都耗費(fèi)大量時(shí)間和資源，并且難以同批對(duì)比大量不同候選因子。這也阻礙了“在體重編程”調(diào)控因子的快速解析及這一再生醫(yī)療策略從概念驗(yàn)證走向轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

精準(zhǔn)導(dǎo)航在體重編程誘導(dǎo)心肌再生的細(xì)胞命運(yùn)擾動(dòng)圖譜

為了精準(zhǔn)定位在體重編程的層層“路障”，批量、系統(tǒng)地鑒定阻礙在體心臟重編程的關(guān)鍵因子，趙揚(yáng)團(tuán)隊(duì)建立了一套研究在體重編程的Perturb-seq技術(shù)流程。他們首先把目標(biāo)范圍縮小在131個(gè)候選基因上——它們?cè)诓±憝h(huán)境中的表達(dá)量高于體外培養(yǎng)并被WGCNA分析判斷為節(jié)點(diǎn)基因，并同時(shí)加上9個(gè)已報(bào)道因子作為參照。隨后，將這140個(gè)因子的shRNA（每個(gè)候選因子選用2條shRNA，每條shRNA載體都帶有唯一的分子標(biāo)簽）隨著重編程因子和熒光蛋白陣列式地轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入激活態(tài)心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)。研究者進(jìn)一步把這些“同時(shí)植入多個(gè)重編程因子和不同分子標(biāo)簽”的成纖維細(xì)胞混合移植進(jìn)入另幾只小鼠的心梗區(qū)域，用Dox誘導(dǎo)重編程因子的表達(dá)，并分別在誘導(dǎo)重編程1周和2周時(shí)間點(diǎn)分離表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞樣品進(jìn)行單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分子標(biāo)簽的RNA測(cè)序，進(jìn)而成功構(gòu)建了一張貫穿在體重編程全過(guò)程的“細(xì)胞命運(yùn)擾動(dòng)圖譜”。“陣列式感染+細(xì)胞移植”的設(shè)計(jì)確保了在體重編程因子遞送非常充分，且每種“擾動(dòng)”的細(xì)胞比例也更為平均。

通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，研究者首先系統(tǒng)性地繪制了從成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞命運(yùn)及其它亞型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞命運(yùn)圖譜。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死的病理背景下，僅有小部分細(xì)胞向心肌命運(yùn)演進(jìn)。大量成纖維細(xì)胞由于微環(huán)境的干擾而陷入“病理”狀態(tài)，如特定亞群高表達(dá)干擾素響應(yīng)基因。通過(guò)對(duì)這一細(xì)胞命運(yùn)圖譜的深入解析，研究人員得以在分子水平上定義重編程過(guò)程中的不同細(xì)胞狀態(tài)，為后續(xù)尋找攔截細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化的“幕后黑手”提供了高精度的細(xì)胞命運(yùn)座標(biāo)系。

通過(guò)分析擾動(dòng)因子對(duì)應(yīng)分子標(biāo)簽的分布，這一圖譜清晰地展示了不同擾動(dòng)因子對(duì)細(xì)胞命運(yùn)走向的調(diào)控作用。通過(guò)計(jì)算每一個(gè)擾動(dòng)因子在命運(yùn)軌跡上的富集程度，研究人員發(fā)現(xiàn)，抑制特定的基因能夠顯著改變細(xì)胞的演化方向，使其繞過(guò)病理阻礙、更高效地誘導(dǎo)特定細(xì)胞亞群，包括誘導(dǎo)心肌細(xì)胞。這個(gè)圖譜還提供了將這100多個(gè)因子進(jìn)行頭對(duì)頭對(duì)比的機(jī)會(huì)，可以針對(duì)任意細(xì)胞群排序候選調(diào)控因子的作用效果。

“罪魁禍?zhǔn)?/strong>”——CALR，成纖維細(xì)胞向心肌轉(zhuǎn)分化的“剎車(chē)片”

在這一信息含量豐富的擾動(dòng)圖譜中，鈣網(wǎng)蛋白（Calr）在心肌樣細(xì)胞群中高度富集，被鑒定為阻礙心肌樣細(xì)胞亞群產(chǎn)生的首要障礙因子。CALR通常定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，調(diào)控鈣離子的儲(chǔ)存和蛋白質(zhì)折疊，同時(shí)也可以定位于胞質(zhì)，是遞呈給巨噬細(xì)胞的“吃我”信號(hào)。研究人員發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死區(qū)域的成纖維細(xì)胞中，CALR的表達(dá)水平顯著升高，且這一現(xiàn)象在人類(lèi)心梗患者的樣本中同樣存在。這意味著，CALR的激活表達(dá)作為細(xì)胞應(yīng)激后的反應(yīng)，卻可能在“無(wú)意中”成為了心肌再生的“剎車(chē)片”。

上述猜想通過(guò)體內(nèi)、外功能實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證。研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了敲低 Calr能顯著提升體內(nèi)和體外場(chǎng)景下的重編程誘導(dǎo)效率。更令人振奮的是，這種提升不僅體現(xiàn)在數(shù)量上，更體現(xiàn)在質(zhì)量上：Calr的敲低使得誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞在體外展現(xiàn)出前所未有的同步鈣信號(hào)振蕩，這意味著它們?cè)诠δ苌细咏δ苄孕募〖?xì)胞。此外，Calr敲低聯(lián)合其他重編程因子的共同作用下，原本極難被誘導(dǎo)為心肌的激活態(tài)心臟成纖維細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了近70%的心肌誘導(dǎo)效率。在體重編程實(shí)驗(yàn)也顯示，Calr敲低也同樣提高心肌樣細(xì)胞的在體誘導(dǎo)效率達(dá)一個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到10-20%。且在人類(lèi)心臟成纖維細(xì)胞上，Calr敲低也同樣大幅提高重編程效率。

“機(jī)制揭秘”——病理應(yīng)激激活Calr通過(guò)Ca2+信號(hào)調(diào)控MEF2C活性

那么，CALR是如何調(diào)控成纖維細(xì)胞向心肌命運(yùn)的重編程呢？

研究團(tuán)隊(duì)分析了多個(gè)線(xiàn)索，逐步將其定位于Ca2+信號(hào)通路的調(diào)控上。敲低CALR會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)釋放Ca2+，引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的階段性提升。這種鈣信號(hào)的大幅提升激活了下游的CaM/CaMKIIδ通路。最為關(guān)鍵的是，無(wú)論是Calr敲低還是通過(guò)L型Ca2+通道激動(dòng)劑提升胞內(nèi)Ca2+濃度，都顯著增強(qiáng)了重編程核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2C的轉(zhuǎn)錄活性，解釋了它們大幅提升重編程效率的原因。在某種程度上，Calr敲低或者Ca2+激活甚至可以替代外源MEF2C，借助心臟成纖維細(xì)胞中原本就內(nèi)源低表達(dá)的MEF2C，并通過(guò)加強(qiáng)其活性來(lái)驅(qū)動(dòng)成纖維細(xì)胞跨越命運(yùn)鴻溝，順利向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這一機(jī)制還將胚胎時(shí)期的心肌發(fā)育機(jī)制與病理環(huán)境下的再生過(guò)程聯(lián)系了起來(lái)，證明了“重啟”發(fā)育程序是實(shí)現(xiàn)高效再生的有效途徑。

圖2. 應(yīng)激信號(hào)通過(guò)調(diào)控鈣離子濃度的時(shí)空調(diào)控影響心臟重編程的機(jī)制解析

技術(shù)革新與未來(lái)展望

該研究是首次將perturb-seq應(yīng)用于“在體重編程”的研究，為“在體重編程”領(lǐng)域?qū)ふ腋嗾{(diào)控靶點(diǎn)提供了新的技術(shù)框架，提示了直接在病理環(huán)境下研究在體重編程的重要性。尤其該研究繪制了心臟成纖維細(xì)胞向心肌以及多個(gè)成纖維細(xì)胞亞群之間命運(yùn)轉(zhuǎn)化的調(diào)控因子圖譜；對(duì)大量候選因子進(jìn)行了在體重編程效果的“頭對(duì)頭”對(duì)比；揭示了CALR在“在體重編程”誘導(dǎo)心臟修復(fù)再生中的核心作用及其通過(guò)調(diào)控Ca2+通路進(jìn)而作用于細(xì)胞命運(yùn)核心轉(zhuǎn)錄因子活性的分子機(jī)制。這一進(jìn)展為治療心?！霸隗w重編程”策略提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)，并提供了具有臨床應(yīng)用潛力的新靶點(diǎn)。

北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所蔡依泓（2022級(jí)博士生）、楊洋（博士后）、楊峻博（2019級(jí)博士生）為論文共同第一作者，北京大學(xué)趙揚(yáng)研究員為通訊作者。研究團(tuán)隊(duì)受天然藥物及仿生藥物全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞增殖與分化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及衰老性重大疾病北京市研究中心、北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)高等研究院、北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院等單位支持。該研究獲國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)（2025YFA0922000；2018YFA0800500）及國(guó)家自然科學(xué)基金（32470882）等資金支持。

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