DNA雙鏈斷裂（Double-Stranded Break）是最具破壞性的DNA損傷形式之一，而經(jīng)典非同源重組（Classical Non-Homologous End Joining，C-NHEJ）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最廣泛、最快速的DNA修復(fù)路徑。

圍繞這一核心過(guò)程，近日，哥倫比亞大學(xué)的Dr. Shan Zha (查珊)組在Genes & Development上發(fā)表綜述文章Nonhomologous end joining—the importance of end tethering and beyond，對(duì)C-NHEJ的動(dòng)態(tài)調(diào)控， 結(jié)構(gòu)機(jī)制及多年的遺傳學(xué)觀察進(jìn)行了系統(tǒng)性梳理。文章把C-NHEJ分解成5 個(gè)主要步驟。重點(diǎn)介紹了非同源重組中的5座鏈接兩個(gè)DNA末端的蛋白質(zhì)橋梁。

在經(jīng)典非同源重組（C-NHEJ）過(guò)程中，DNA雙鏈斷裂的修復(fù)并非簡(jiǎn)單的線性反應(yīng)，而是一個(gè)由多個(gè)結(jié)構(gòu)節(jié)點(diǎn)協(xié)同驅(qū)動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。整體可概括為五個(gè)連續(xù)但相互耦合的步驟：首先，斷裂末端由Ku70/Ku80快速識(shí)別并結(jié)合（Step 1: end binding），形成穩(wěn)定的DNA端保護(hù)結(jié)構(gòu)；隨后招募DNA-PKcs – 一個(gè)大型激酶（Step 2: end-protection）。在激活前，DNA-PKcs和DNA末端形成非共價(jià)連接，保護(hù)DNA末端不被降解。解釋為什么表達(dá)激酶失活的DNA-PKcs 會(huì)完全阻止C-NHEJ。不同于同源重組或MMEJ， 非同源重組不依賴于DNA末端相似性，而完全靠非同源重組蛋白形成框架。所以修復(fù)過(guò)程的核心并非單一連接，而是由多個(gè)蛋白橋梁 （Step 3： end-tethering） 把兩個(gè)DNA末端維系在一起。 哺乳動(dòng)物至少包含五種已知的結(jié)構(gòu)性橋接：Ku80 和對(duì)側(cè)DNA-PKcs之間的跨端結(jié)合、兩側(cè)DNA-PKcs 和DNA-PKcs復(fù)合體形成的空間支架、由Ku-LIG4-XRCC4-XLF-XRCC4-LIG4-Ku介導(dǎo)的跨分子W型機(jī)構(gòu), XLF 雙聚體末端和兩側(cè)Ku80的直接鏈接，以及PAXX雙聚體末端與兩側(cè)Ku70的穩(wěn)定結(jié)合增強(qiáng)局部連接。 這些橋接并非完全冗余備份，而是共同構(gòu)建一個(gè)多點(diǎn)連接體系，其中任意單一橋接的缺失往往可以被其他路徑部分補(bǔ)償，而當(dāng)超過(guò)三個(gè)橋接同時(shí)受損時(shí)則會(huì)導(dǎo)致修復(fù)失敗。這也解釋了，為什么XLF/PAXX， XLF/DNA-PK 雙敲除的小鼠和小鼠細(xì)胞會(huì)完全失去非同源重組。 隨后，斷裂末端根據(jù)需要進(jìn)行核酸加工與修整（Step4: end processing - 包括Artemis 和Polymerase），以生成可連接的結(jié)構(gòu)；最終，由XRCC4–LIG4復(fù)合體完成DNA末端的共價(jià)連接（Step 5: End-ligation）。這一“5步驟–5橋接” 的框架強(qiáng)調(diào)，C-NHEJ的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)化成一條依賴多重結(jié)構(gòu)約束，穩(wěn)定與動(dòng)態(tài)平衡的分子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而蛻變成一條高效，抗干擾能力很強(qiáng)的快速DNA修復(fù)通路。

綜述深入探討了近十年的結(jié)構(gòu)學(xué)發(fā)現(xiàn)，并用這些知識(shí)解釋了過(guò)去20年的遺傳學(xué)上觀察到的功能冗余性及在不同生理背景下的高度適應(yīng)性。文章結(jié)尾，作者還總結(jié)了經(jīng)典非同源重組通路目前的一些問(wèn)題，為同學(xué)們?nèi)腴T和外行學(xué)習(xí)經(jīng)典非同源重組提供了很好的參考。

查珊實(shí)驗(yàn)室的博士后Dr. Geunil Yi 為綜述繪制了結(jié)構(gòu)圖像。

值得一提的是，此前查珊實(shí)驗(yàn)室和張朝林實(shí)驗(yàn)室合作，在Nature發(fā)表文章Ku limits RNA-induced innate immunity to allow Alu expansion in primates，發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中（HCT116 和HEK293）Ku的缺失會(huì)迅速觸發(fā)以MDA5和RIG-I為核心、通過(guò)MAVS傳導(dǎo)的dsRNA先天免疫通路，導(dǎo)致干擾素和NF-κB信號(hào)強(qiáng)烈激活。雖然干擾素本身不會(huì)致死，但干擾素效應(yīng)和NF-κB會(huì)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)其它核酸免疫感受蛋白-PKR， OAS， RIG-I等等。隨著Ku持續(xù)下降，細(xì)胞進(jìn)一步啟動(dòng)dsRNA-PKR介導(dǎo)的翻譯抑制以及dsRNA誘導(dǎo)的OAS–RNase L通路對(duì)核糖體RNA的降解，最終引發(fā)生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞死亡。敲除MAVS、RIG-I或MDA5可顯著緩解干擾素反應(yīng)，而PKR缺失則可部分恢復(fù)細(xì)胞生長(zhǎng)，表明Ku的“必需性”源于其抑制內(nèi)源dsRNA誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的作用。

機(jī)制上，哥倫比亞大學(xué)的張朝林實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分析Ku-irCLIP數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中，Ku通過(guò)結(jié)合廣泛存在的dsRNA結(jié)構(gòu)，包括rRNA， tRNA， microRNA， 但尤其是來(lái)源于靈長(zhǎng)類特有Alu元件，特別是反向的Alu的stem-loop結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)主要分布于內(nèi)含子和3'非翻譯區(qū)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Ku表達(dá)水平與Alu擴(kuò)增高度相關(guān)（Pearson R=0.94/0.95），在靈長(zhǎng)類中顯著升高，而在非靈長(zhǎng)類動(dòng)物中較低，提示Ku與Alu在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了功能耦合。因此，Ku不僅是DNA修復(fù)因子，更作為一種 “RNA緩沖器”，通過(guò)結(jié)合并隔離Alu來(lái)源的dsRNA，防止其被誤識(shí)別為病毒，從而抑制異常的先天免疫激活。這一模型不僅解釋了Ku在人類細(xì)胞中的高表達(dá)與必需性，也揭示了基因組進(jìn)化（Alu擴(kuò)張）如何重塑基礎(chǔ)分子機(jī)制，使DNA修復(fù)蛋白獲得維持RNA穩(wěn)態(tài)與免疫平衡的關(guān)鍵功能，打開(kāi)了Ku作為靈長(zhǎng)類特有的RNA調(diào)節(jié)蛋白的新研究領(lǐng)域。

https://genesdev.cshlp.org/content/40/7-8/411.long

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09104-w

制版人： 十一

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