好消息：博士讀完了，基金本子寫完了。

壞消息：頭發(fā)沒熬過它們，提前提交了‘離職申請’。

以前覺得‘聰明絕頂’是個夸張的修辭，現(xiàn)在才知道，這是學(xué)術(shù)圈最寫實的畢業(yè)要求。

毛發(fā)變白治療困境亟待突破

白發(fā)是人類衰老的顯著標(biāo)志之一，但其背后隱藏著復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制。毛發(fā)變白直接源于毛囊中功能性黑色素細(xì)胞的不足和黑色素生成能力的下降。白癜風(fēng)、早發(fā)性白發(fā)、橋本甲狀腺炎等色素性疾病影響著全球0.5%至2%的人口，給患者帶來心理和生理上的雙重負(fù)擔(dān)。然而，由于毛囊黑色素細(xì)胞位于皮膚深層的真皮層，現(xiàn)有的大分子藥物經(jīng)皮遞送效率極低，而口服或靜脈注射對皮膚及皮膚附屬器疾病效果有限。傳統(tǒng)的透皮促滲劑會破壞皮膚屏障功能并引起刺激，微針技術(shù)雖能穿透角質(zhì)層，但頻繁使用會造成皮膚損傷。因此，開發(fā)高效、安全的生物大分子經(jīng)皮遞送系統(tǒng)成為治療毛發(fā)變白的關(guān)鍵瓶頸。

白頭發(fā)終于有救了

針對這一挑戰(zhàn)，上海交通大學(xué)金鑫副研究員、朱新遠(yuǎn)教授團(tuán)隊設(shè)計了一種基于聚合酪氨酸酶納米膠囊的透皮治療方案，可直接激活局部黑色素細(xì)胞并原位刺激黑色素生成。研究團(tuán)隊通過優(yōu)化納米膠囊的尺寸和表面電位，顯著增強(qiáng)了皮膚滲透性并保持了酶活性。nTYRs能夠高效地將活性酪氨酸酶通過角質(zhì)層遞送至毛囊黑色素細(xì)胞，在小鼠和人類黑色素細(xì)胞模型、豬和人類皮膚模型中均實現(xiàn)了快速而顯著的毛發(fā)復(fù)色。研究還建立了一種免疫介導(dǎo)的內(nèi)源性白發(fā)小鼠模型，更真實地模擬了人類病理生理過程。相關(guān)論文以“Direct Activation of Follicular Melanocytes by Polymeric Tyrosinase Nanocapsules for Reversing Hair Graying”為題，發(fā)表在ACS Nano上。

示意圖1. 經(jīng)皮遞送的 nTYRs 通過促進(jìn)原位黑色素生成，誘導(dǎo)毛發(fā)變白疾病中的毛發(fā)復(fù)色。

圖1. 經(jīng)皮遞送納米膠囊的合成與表征。(a) 經(jīng)皮遞送納米膠囊通過原位聚合法制備。以丙烯酰胺（AM）為單體、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS）為交聯(lián)劑，通過原位聚合合成蛋白納米膠囊，得到以蛋白為核、PAM為聚合物殼層的納米膠囊。聚合物殼層的表面特性可通過調(diào)節(jié)單體比例和聚合時間進(jìn)行定制。(b) 天然蛋白及具有負(fù)Zeta電位的納米膠囊的動態(tài)光散射結(jié)果。(c) 天然蛋白及不同尺寸納米膠囊的透射電鏡圖像。(d) 天然蛋白及不同尺寸納米膠囊的Zeta電位。數(shù)據(jù)表示為三次獨立實驗的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

研究團(tuán)隊首先系統(tǒng)探究了納米膠囊的透皮促滲機(jī)制。他們以白蛋白和聚丙烯酰胺為模型，合成了尺寸在20至200納米、表面電位在-10 mV至+20 mV范圍內(nèi)的一系列納米膠囊。動態(tài)光散射和透射電子顯微鏡表征顯示，天然蛋白的直徑約為6納米，而納米膠囊的直徑可從約20納米調(diào)控至200納米以上。通過添加帶氨基的陽離子單體，團(tuán)隊成功調(diào)節(jié)了納米膠囊的表面電位。體外透皮實驗采用與人類皮膚結(jié)構(gòu)高度相似的豬皮膚模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有200納米以下的納米膠囊均顯示出比天然蛋白顯著增加的滲透深度，24小時后可穿過整個表皮甚至到達(dá)真皮層。值得注意的是，在相同尺寸下，帶正電位的納米膠囊表現(xiàn)出更優(yōu)異的促滲效果，能夠更深入地進(jìn)入真皮層。其中，50納米的帶正電納米膠囊在真皮層的相對積累量達(dá)到25.78%，是唯一在該深度積累比例超過25%的組別。傅里葉變換紅外光譜分析顯示，正電性納米膠囊處理降低了角質(zhì)層中脂質(zhì)對應(yīng)的吸收峰強(qiáng)度，表明其通過破壞脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)、形成水性通道來協(xié)助納米膠囊運輸?；诔叽绾捅砻骐娢贿@兩個關(guān)鍵因素，研究團(tuán)隊建立了預(yù)測納米膠囊滲透系數(shù)的數(shù)學(xué)模型，該模型能夠根據(jù)納米膠囊的zeta電位、直徑和殼層材料參數(shù)預(yù)測其24小時的滲透深度，為后續(xù)系統(tǒng)設(shè)計提供了理論指導(dǎo)。

圖2. 納米膠囊的體外滲透性。(a) FITC標(biāo)記納米膠囊滲透1、4、24小時后皮膚的共聚焦圖像。(b) 不同尺寸和Zeta電位納米膠囊的滲透深度。(c) 沿滲透路徑0-200 μm范圍內(nèi)納米膠囊的相對蓄積值。(d) 納米膠囊沿滲透路徑的相對蓄積分布比例。(e) 經(jīng)水、天然蛋白、NCs-20+、NCs-50+、NCs-100+、NCs-150+和NCs-200+處理24小時后角質(zhì)層脂質(zhì)含量的FT-IR光譜。(f) 具有不同表面特性和尺寸的納米膠囊在豬皮膚上表現(xiàn)出不同的滲透性。(g) 不同納米膠囊處理后皮膚的相對脂質(zhì)含量。(h,i) 具有負(fù)或正Zeta電位、尺寸小于250 nm的納米膠囊在24小時的滲透深度實驗數(shù)據(jù)與預(yù)測數(shù)據(jù)。

在確定了最佳透皮參數(shù)后，團(tuán)隊合成了不同尺寸的帶正電酪氨酸酶納米膠囊。酶活性測試顯示，nTYR-20+和nTYR-50+的活性損失小于10%，而nTYR-100+的活性損失超過75%，nTYR-150+和nTYR-200+幾乎完全失活。這歸因于過厚的聚合物殼層阻礙了底物向酶活性中心的傳輸。在穩(wěn)定性方面，天然酪氨酸酶在60°C孵育0.5小時后活性損失超過86%，1小時后幾乎完全失活；而nTYR-20+和nTYR-50+在40°C處理1小時后活性損失小于20%，60°C處理1小時后損失小于60%。針對皮膚pH值從4到8的變化，nTYRs在不同pH環(huán)境下均表現(xiàn)出更穩(wěn)定的活性，尤其是在堿性條件下。綜合催化活性、滲透性和制備成本，研究團(tuán)隊選擇nTYR-20+進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3. 不同尺寸nTYRs在不同條件下的酶活性。(a) DLS測量的TYR和nTYRs的尺寸。(b) 不同尺寸nTYRs在聚合物殼層制備后的酶活性保留率。(c) 天然TYR、nTYR-20+、nTYR-50+和nTYR-100+在40°C或60°C加熱處理0.5或1小時后的活性保留率。(d) 天然TYR、nTYR-20+、nTYR-50+和nTYR-100+在不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性。

為驗證nTYRs的安全性，團(tuán)隊在五種細(xì)胞系上進(jìn)行了細(xì)胞毒性測試，包括人角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及三種黑色素細(xì)胞。結(jié)果顯示，TYR和nTYR處理48小時后的細(xì)胞毒性均在可接受范圍內(nèi)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，nTYRs在2小時內(nèi)被黑色素細(xì)胞攝取，且由于正電荷表面特性，nTYR組的熒光強(qiáng)度更高。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nTYR處理后，黑色素細(xì)胞的樹突數(shù)量顯著增加，樹突長度明顯增長，并出現(xiàn)二級或三級分支——這在PIG3 V細(xì)胞中尤為突出，nTYR組的平均樹突長度是PBS組的1.94倍。黑色素顆粒的觀察和定量分析證實，nTYR組細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒聚集體顯著更多、更大。在正常黑色素細(xì)胞中，nTYR組的黑色素顆粒相對量是TYR組的1.8倍?？傮w黑色素含量評估顯示，nTYRs的促黑色素生成能力優(yōu)于TYRs：在正常黑色素細(xì)胞中，nTYRs比PBS組增加了14%以上的黑色素含量；在白癜風(fēng)細(xì)胞PIG3 V中，這一增幅高達(dá)22.3%。與經(jīng)典酪氨酸酶激活劑8-甲氧基補(bǔ)骨脂素相比，nTYRs在PIG1細(xì)胞中的促黑色素生成因子達(dá)到了3.72，而TYR僅為2.33。

圖4. nTYRs的促黑色素生成能力。(a) nTYRs通過增強(qiáng)局部黑素細(xì)胞的黑色素生成和黑色素小體轉(zhuǎn)運來促進(jìn)原位色素沉著。(b-f) 8-MOP、TYR和nTYR在5種不同細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞、L929細(xì)胞、HEM細(xì)胞、PIG1細(xì)胞和PIG3 V細(xì)胞）上的細(xì)胞毒性。(g,h) HEM細(xì)胞和PIG3 V細(xì)胞對TYRs和nTYRs的攝取。(i) 經(jīng)PBS、TYRs和nTYRs處理后3種不同黑素細(xì)胞的共聚焦圖像。(j-l) 經(jīng)PBS、TYRs和nTYRs處理后3種不同黑素細(xì)胞中黑色素顆粒的相對數(shù)量。(m-o) 3種不同黑素細(xì)胞樹突相對長度的統(tǒng)計結(jié)果。(p-r) 3種不同黑素細(xì)胞中黑色素增加率及與8-MOP相比的促進(jìn)因子。

透皮滲透實驗進(jìn)一步證實，nTYRs比TYRs具有更深的皮膚滲透能力，能夠到達(dá)真皮層。在三維人表皮模型EpiKuits上，nTYRs處理24小時后可到達(dá)表皮模型底部，而TYR的熒光信號主要停留在模型上層。三維人黑色素皮膚模型MelaKuits的結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了nTYRs的透皮滲透性和促黑色素生成能力。

圖5. nTYR的經(jīng)皮滲透性。(a-c) FITC標(biāo)記的TYR和nTYR在豬皮膚中滲透1、4和24小時后的分布。(d) FITC標(biāo)記的TYR和nTYR在EpiKuits模型中滲透24小時后的分布。

研究團(tuán)隊隨后在白發(fā)小鼠模型中驗證了nTYRs誘導(dǎo)毛發(fā)復(fù)色的療效。他們利用B16F10黑色素瘤細(xì)胞在C57BL/6小鼠背部誘導(dǎo)局部CD8+ T細(xì)胞過表達(dá)，建立了模擬人類白發(fā)患者毛囊周圍微環(huán)境的內(nèi)源性白發(fā)模型。經(jīng)過20天的局部給藥，nTYRs處理組小鼠皮膚的角質(zhì)層保持了與對照組相同的微形態(tài)特征，表皮厚度和皮膚厚度變化可忽略不計，且未顯示任何全身毒性跡象。新生毛發(fā)的超景深顯微鏡觀察顯示，nTYR組出現(xiàn)了更明顯的深色毛發(fā)，表明nTYR對毛囊色素沉著的影響不僅體現(xiàn)在毛干上，也體現(xiàn)在新生毛發(fā)的深色尖端。通過對背部給藥區(qū)域進(jìn)行分區(qū)定量分析，nTYR組在脫色面積擴(kuò)展和色差增加方面均表現(xiàn)出明顯的緩解效果，尤其在遠(yuǎn)離手術(shù)區(qū)域的第3區(qū)，nTYRs對脫色擴(kuò)散的緩解趨勢更為顯著。組織學(xué)分析顯示，nTYRs促進(jìn)了毛囊生長，毛囊數(shù)量增加了73.4%，毛囊長度增加了90.5%。黑色素染色結(jié)果顯示，nTYR組毛囊中的毛干出現(xiàn)了明顯的色素沉著。

圖6. 基于nTYR的治療對毛發(fā)變白小鼠逆轉(zhuǎn)毛發(fā)變白和誘導(dǎo)復(fù)色的效果。(a) 實驗設(shè)計示意圖。(b,d) 陰性對照組、未處理對照組、PBS組和nTYR組從毛發(fā)變白早期到進(jìn)展期剃毛區(qū)域的脫色情況。(c) 小鼠背部剃毛的超景深顯微鏡照片。(e) 剃毛區(qū)域分區(qū)示意圖。(fg) 各組脫色色差和面積比的分區(qū)及整體統(tǒng)計。

與臨床白癜風(fēng)藥物魯索替尼及天然酪氨酸酶的對比研究顯示，盡管魯索替尼減少了毛囊周圍的CD8+ T細(xì)胞積聚，但黑色素細(xì)胞的保留仍然不足；而nTYR組則表現(xiàn)出更好的黑色素細(xì)胞保留。在脫色面積擴(kuò)散和色差增加的緩解能力上，nTYRs均顯著優(yōu)于魯索替尼和天然TYR。nTYR組的平均色差變化為5.87，僅為TYR組的30.2%。TYR組較弱的脫色緩解效果可能歸因于其經(jīng)皮遞送效率低、細(xì)胞攝取能力差以及酶活性損失。此外，由于活動性白癜風(fēng)患者體內(nèi)存在酪氨酸酶抗體，TYR可能被識別和清除。相比之下，nTYRs即使在CD8+ T細(xì)胞攻擊未被抑制的情況下，仍顯示出激活存活休眠黑色素細(xì)胞的潛力。

圖7. nTYR組與蘆可替尼組、nTYR組與TYR組的復(fù)色效果比較。(a) 各組小鼠皮膚H&E染色和Masson-Fontana染色圖像。(b,c) 未處理對照組、PBS組、蘆可替尼組、TYR組和nTYR組的脫色色差和面積比。(d,e) 未處理對照組、PBS組、蘆可替尼組、TYR組和nTYR組的毛囊數(shù)量和長度。(f) nTYR組小鼠皮膚Masson-Fontana染色放大圖像。(g) PBS組、蘆可替尼組、TYR組和nTYR組小鼠皮膚中CD8+ T細(xì)胞和黑素細(xì)胞的免疫熒光圖像。

本研究開發(fā)的高效經(jīng)皮遞送酪氨酸酶納米系統(tǒng)為直接治療毛發(fā)變白提供了有前景的新策略。nTYRs對黑色素細(xì)胞的激活機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究，該策略不僅有望用于毛囊復(fù)色，還可拓展至更廣泛的皮膚復(fù)色場景，如白癜風(fēng)。值得注意的是，盡管nTYRs不靶向黑色素細(xì)胞功能障礙的上游發(fā)病機(jī)制，但其直接的促黑色素生成能力和黑色素細(xì)胞激活效應(yīng)與現(xiàn)有療法并不沖突，具有良好的協(xié)同應(yīng)用潛力。此外，該納米載體系統(tǒng)及建立的滲透模型為基于納米膠囊和納米凝膠的經(jīng)皮藥物遞送提供了新的理論描述，其應(yīng)用可超越毛發(fā)變白，拓展至其他皮膚疾病的生物大分子經(jīng)皮遞送。面向臨床轉(zhuǎn)化，殼層材料的設(shè)計需根據(jù)蛋白質(zhì)載貨要求、目標(biāo)滲透深度和體內(nèi)生物降解行為進(jìn)行定制，未來的材料選擇應(yīng)在生物安全性和組裝兼容性之間取得平衡，以優(yōu)化轉(zhuǎn)化潛力。