以sCMOS相機(jī)為同步采樣核心，在單次曝光中并行獲取四通道相移干涉信息，構(gòu)建時(shí)間統(tǒng)一的數(shù)據(jù)采集機(jī)制，實(shí)現(xiàn)高速、高靈敏度的定量相位成像。

1.實(shí)驗(yàn)背景

定量相位成像（Quantitative Phase Imaging,QPI）能夠在無標(biāo)記條件下重建細(xì)胞與組織的光學(xué)厚度、折射率及干質(zhì)量分布，是研究活體細(xì)胞動(dòng)態(tài)行為的關(guān)鍵技術(shù)路徑。然而傳統(tǒng)空間光干涉顯微（SLIM）系統(tǒng)依賴多幀相移采集，時(shí)間分辨率通常受限于串行調(diào)制與逐幀曝光過程，難以滿足毫秒尺度生物過程的連續(xù)觀測(cè)需求。

上述瓶頸本質(zhì)上源自成像系統(tǒng)缺乏能夠在單幀內(nèi)完成多通道同步采樣的檢測(cè)器件。針對(duì)此瓶頸，深圳大學(xué)科研團(tuán)隊(duì)構(gòu)建并行四步相移架構(gòu)的SE-SLIM系統(tǒng)，通過引入千眼狼（Revealer）sCMOS相機(jī)作為核心采集單元，使四路相移信息在同一時(shí)間基準(zhǔn)下完成記錄，從數(shù)據(jù)源層面重構(gòu)定量相位成像的時(shí)間結(jié)構(gòu)。

2.實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由明場(chǎng)顯微鏡與定量相位成像模塊構(gòu)成，其中關(guān)鍵檢測(cè)單元為千眼狼（Revealer）Gloria 4.2 sCMOS相機(jī)，核心參數(shù)為：2048×2048像素分辨率，6.5 μm像元尺寸，全畫幅下幀率135 fps，采用BSI 科學(xué)級(jí)圖像傳感器，具備低讀出噪聲和高量子效率95%特性，為弱光干涉條紋的精確記錄提供硬件基礎(chǔ)。

系統(tǒng)光路部分采用雙級(jí)聯(lián)非偏振分束器與直角反射棱鏡結(jié)構(gòu)，將入射光均勻分為四束等強(qiáng)光，并通過空間光調(diào)制器（SLM）分別加載0°、90°、180°與270°相位調(diào)制。四束光在像面形成空間分離的四窗口干涉圖像，并由sCMOS相機(jī)在單次曝光中同步記錄。

在該系統(tǒng)中，sCMOS相機(jī)不僅承擔(dān)成像記錄功能，更作為四通道相移干涉信息的同步采樣核心，直接決定系統(tǒng)時(shí)間分辨率、相位噪聲水平及定量測(cè)量精度。

3.實(shí)驗(yàn)方法

研究采用并行四步相移與單次曝光相結(jié)合的成像方案，SLM對(duì)四路光束施加離散相位調(diào)制，sCMOS相機(jī)在單幀曝光內(nèi)同步捕獲四幅相移強(qiáng)度圖像，經(jīng)窗口分割與配準(zhǔn)后，通過反正切函數(shù)完成相位反演。

該實(shí)驗(yàn)方法成功的前提在于四幅相移圖像在同一時(shí)間點(diǎn)獲取，依賴于sCMOS相機(jī)的大面陣并行讀出能力。

實(shí)驗(yàn)分別對(duì)DMSO刺激下的紅細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，由sCMOS相機(jī)完成高速時(shí)序圖像采集，記錄細(xì)胞形態(tài)演變與干質(zhì)量動(dòng)態(tài)變化過程，并基于sCMOS原始序列數(shù)據(jù)開展定量分析。

4. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解析（基于sCMOS相機(jī)圖像采集結(jié)果分析）

千眼狼（Revealer）Gloria 4.2 sCMOS相機(jī)在系統(tǒng)標(biāo)定、相位重建及動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像中提供直接觀測(cè)證據(jù)。

4.1 系統(tǒng)采集機(jī)制

傳統(tǒng)SLIM系統(tǒng)需要四次獨(dú)立的相機(jī)曝光才能獲取一組完整的四步相移數(shù)據(jù)，Gloria 4.2 sCMOS相機(jī)單次觸發(fā)即可完成四通道同步采集，較傳統(tǒng)SLIM系統(tǒng)時(shí)間分辨率提升4倍，實(shí)現(xiàn)時(shí)間維度上的統(tǒng)一采樣。圖1為傳統(tǒng)SLIM與SE-SLIM數(shù)據(jù)獲取方式對(duì)比。

圖1 sCMOS相機(jī)單次曝光四通道同步采集機(jī)制，對(duì)比傳統(tǒng)多幀采集流程，體現(xiàn)時(shí)間統(tǒng)一采樣能力

sCMOS相機(jī)在此承擔(dān)“時(shí)間統(tǒng)一采樣器”的角色，單幀多通道采集能力是實(shí)現(xiàn)單次曝光相位恢復(fù)的必要條件。

4.2 系統(tǒng)標(biāo)定與相位靈敏度

圖2為系統(tǒng)分辨率與相位靈敏度標(biāo)定結(jié)果。得益于sCMOS相機(jī)高分辨率與低讀出噪聲，系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)＜500 nm相位分辨率，空間相位靈敏度達(dá)1.84 nm，時(shí)間相位靈敏度達(dá)0.82 nm；sCMOS連續(xù)256 fps采集的時(shí)序相位波動(dòng)統(tǒng)計(jì)顯示，隨機(jī)像素相位值分布高度集中，無明顯漂移與噪聲突變。

圖2基于sCMOS高速連續(xù)采集的相位噪聲統(tǒng)計(jì)結(jié)果，展示時(shí)間相位穩(wěn)定性與納米級(jí)靈敏度來源

測(cè)量結(jié)果表明sCMOS相機(jī)可提供長(zhǎng)時(shí)間高速穩(wěn)定采集能力，低讀出噪聲與高量子效率直接體現(xiàn)在納米級(jí)相位靈敏度上，為定量相位測(cè)量提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)顆粒定量成像一致性驗(yàn)證

圖3為10 μm聚苯乙烯微球sCMOS采集與相位重建結(jié)果。sCMOS相機(jī)清晰捕捉微球干涉信號(hào)，無信號(hào)丟失與畸變，重建后微球平均直徑為10.48 μm，測(cè)量誤差＜4%；平均相位峰值與理論值偏差亦＜4%。

圖3 sCMOS相機(jī)采集的微球干涉信號(hào)及相位重建一致性統(tǒng)計(jì)，驗(yàn)證其在定量測(cè)量中的線性響應(yīng)與穩(wěn)定性

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明該sCMOS相機(jī)在弱干涉信號(hào)采集、高精度定量測(cè)量中具備高可靠性，可滿足定量相位成像要求。

4.4 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)

圖4為紅細(xì)胞與HeLa細(xì)胞動(dòng)態(tài)sCMOS成像序列，sCMOS相機(jī)以135 fps完成6.4 s連續(xù)無間斷采集，精準(zhǔn)捕捉紅細(xì)胞滲透膨脹、凹陷扁平化，以及HeLa細(xì)胞快速收縮、膜結(jié)構(gòu)破損與囊泡形成等毫秒級(jí)動(dòng)態(tài)過程。

圖4 sCMOS相機(jī)135 fps連續(xù)采集的細(xì)胞動(dòng)態(tài)序列及干質(zhì)量演化曲線，體現(xiàn)其在高速生物過程觀測(cè)中的時(shí)間連續(xù)性

基于sCMOS高幀率時(shí)序數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)成功定量分析細(xì)胞中心區(qū)域干質(zhì)量動(dòng)態(tài)演變，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞無標(biāo)記、實(shí)時(shí)、定量監(jiān)測(cè)，體現(xiàn)sCMOS相機(jī)在快速生物動(dòng)態(tài)事件捕獲中具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。

5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

I.本研究構(gòu)建的基于并行四步相移的SE-SLIM定量相位成像系統(tǒng)，以sCMOS相機(jī)為核心數(shù)據(jù)采集節(jié)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)單次曝光條件下的四通道相移信息同步獲取。

II.千眼狼（Revealer） Gloria 4.2 sCMOS相機(jī)的高幀率、低噪聲、大面陣在并行四步相移定量相位成像系統(tǒng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用：

高幀率（135 fps） 使得單次曝光同時(shí)采集四幅相移圖成為可能，將時(shí)間分辨率提升至傳統(tǒng)SLIM的4倍，并實(shí)現(xiàn)對(duì)DMSO誘導(dǎo)下紅細(xì)胞和HeLa細(xì)胞毫秒級(jí)形態(tài)變化的完整記錄。同時(shí)低噪聲特性支撐了納米級(jí)相位靈敏度，大面陣（2048×2048）特性則保障了多窗口分割后的有效空間分辨率。

III.本研究表明，在并行四步相移定量相位成像架構(gòu)中，sCMOS相機(jī)不再是可替換組件，而是決定系統(tǒng)是否能夠?qū)崿F(xiàn)單次曝光相位恢復(fù)的關(guān)鍵器件。該研究可為高速、無標(biāo)記活細(xì)胞定量觀測(cè)提供一種設(shè)備級(jí)實(shí)現(xiàn)路徑。