合瓣花（花瓣融合成花冠筒）是被子植物中一個重要的形態(tài)創(chuàng)新，尤其在菊類植物中普遍存在。根據(jù)發(fā)育方式的不同，合瓣花可分為晚期合瓣（花瓣原基獨(dú)立起始，后期再融合）和早期合瓣（花瓣原基直接由環(huán)狀原基共同發(fā)育而來）。菊科植物是典型的早期合瓣花類群，其頭狀花序由邊緣的舌狀花和中央的管狀花構(gòu)成，其中舌狀花的花冠筒融合程度在不同品種間呈現(xiàn)豐富的連續(xù)變異（從平到匙、再到管瓣），這為研究早期合瓣花的發(fā)育機(jī)制提供了理想模型。然而，與晚期合瓣花中已報道的NAM、WOX1等調(diào)控基因不同，早期合瓣花冠筒形成的遺傳基礎(chǔ)長期以來是一個“黑匣子”。菊花的栽培種多為高度雜合的多倍體，傳統(tǒng)遺傳學(xué)手段難以精確定位關(guān)鍵基因。

近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院陳發(fā)棣教授團(tuán)隊在PNAS上在線發(fā)表了題為An auxin-induced transcriptional cascade CmBES1-CmSAUR66 orchestrates the ray floret development inChrysanthemum morifolium的研究論文，揭示了生長素調(diào)控菊花舌狀花發(fā)育的新機(jī)制。

為了破解這一難題，研究團(tuán)隊利用200份切花菊種質(zhì)資源進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），結(jié)合不同花型（平瓣與管瓣）的轉(zhuǎn)錄組比較，成功鑒定到一個與花冠筒融合程度顯著關(guān)聯(lián)的候選基因——CmSAUR66。該基因編碼一個典型的早期生長素響應(yīng)蛋白（SAUR家族），在平瓣品種中的表達(dá)量顯著高于管瓣品種。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，它與擬南芥的AtSAUR66親緣最近，因此得名。

圖1 全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定CmSAUR66為菊花舌狀花形態(tài)調(diào)控候選基因

通過amiR沉默載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化菊花品種‘神馬’，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)：在CmSAUR66表達(dá)量下降49%~69%的轉(zhuǎn)基因株系中，舌狀花的花冠筒融合程度顯著增加。更為關(guān)鍵的是，掃描電鏡觀察顯示，在野生型中本應(yīng)早期停止伸長的背側(cè)花瓣原基，在CmSAUR66沉默株系中持續(xù)發(fā)育，與腹側(cè)花瓣同步伸長，最終形成管狀花。這表明CmSAUR66是花冠筒融合的負(fù)調(diào)控因子，其功能是通過特異性抑制背側(cè)花瓣的伸長來實現(xiàn)的。

圖2 CmSAUR66通過抑制背瓣發(fā)育負(fù)調(diào)控舌狀花花冠筒融合

那么，CmSAUR66如何實現(xiàn)對背側(cè)花瓣伸長的抑制？研究團(tuán)隊將目光投向了已知的背腹極性基因CmCYC2c（一個TCP轉(zhuǎn)錄因子）。RNA原位雜交結(jié)果顯示：在野生型菊花中，CmCYC2c在發(fā)育早期（Ⅲ期）于背側(cè)和腹側(cè)花瓣原基中均有表達(dá)，但隨著發(fā)育推進(jìn)（Ⅳ-Ⅴ期），其在背側(cè)花瓣中的表達(dá)逐漸減弱，僅保留在腹側(cè)；而在CmSAUR66沉默株系中，CmCYC2c在背側(cè)和腹側(cè)花瓣中均持續(xù)高表達(dá)。RT-qPCR也證實，CmSAUR66沉默后CmCYC2c的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。為了驗證二者的遺傳關(guān)系，團(tuán)隊在CmSAUR66沉默背景下利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)瞬時沉默CmCYC2c。結(jié)果顯示，同時沉默兩個基因后，增強(qiáng)的冠管融合表型得到部分恢復(fù)。這說明CmSAUR66主要通過抑制背側(cè)花瓣中CmCYC2c的表達(dá)來限制其伸長，從而維持平瓣形態(tài)。

圖3 CmSAU66通過CmCYC2c調(diào)控花瓣背腹不對稱性

既然CmSAUR66是一個早期生長素響應(yīng)基因，生長素信號必然參與其中。研究團(tuán)隊首先用10 μM IAA處理菊花花序，發(fā)現(xiàn)CmSAUR66的轉(zhuǎn)錄在2分鐘內(nèi)迅速誘導(dǎo)，30分鐘達(dá)到峰值——這是典型的早期響應(yīng)模式。然而，當(dāng)進(jìn)行持續(xù)每天噴施生長素直至開花時，意想不到的現(xiàn)象出現(xiàn)了：雖然外源生長素顯著促進(jìn)了野生型舌狀花冠筒融合，但CmSAUR66的表達(dá)反而被抑制了。這一矛盾暗示存在一個“二次響應(yīng)”因子：在持續(xù)生長素處理下，上游某個轉(zhuǎn)錄因子被激活，進(jìn)而抑制了CmSAUR66的轉(zhuǎn)錄。

圖4 生長素介導(dǎo)CmSAUR66調(diào)控菊花舌狀花花冠筒融合

通過酵母單雜交文庫篩選，團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)核心BR信號轉(zhuǎn)錄因子CmBES1能夠直接結(jié)合CmSAUR66的啟動子。ChIP-qPCR、EMSA和雙熒光素酶報告實驗進(jìn)一步證實：CmBES1蛋白特異性識別CmSAUR66啟動子上的E-box元件（CATGTG），并抑制其轉(zhuǎn)錄活性。在過表達(dá)CmBES1的轉(zhuǎn)基因菊花中，CmSAUR66的表達(dá)量顯著下降。重要的是，持續(xù)生長素處理能夠顯著誘導(dǎo)CmBES1的表達(dá)（而非瞬時誘導(dǎo)）。這完美解釋了上述矛盾：短期生長素處理直接誘導(dǎo)CmSAUR66，而長期處理則通過誘導(dǎo)CmBES1反過來抑制CmSAUR66。

為了確立二者的遺傳關(guān)系，團(tuán)隊在CmBES1過表達(dá)植株中利用TRV病毒瞬時過表達(dá)CmSAUR66。結(jié)果顯示：僅過表達(dá)CmBES1會導(dǎo)致管瓣化，而同時過表達(dá)CmSAUR66則顯著挽救了該表型，接近于野生型水平。這表明CmSAUR66在遺傳上位于CmBES1的下游，且二者對花冠筒融合的調(diào)控具有上位性。

圖5 CmSAUR66作用于CmBES1下游調(diào)控花冠筒融合

綜合以上發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊提出了如下工作模型：在菊花舌狀花發(fā)育過程中，相對較高的生長素水平誘導(dǎo)CmBES1表達(dá)，CmBES1直接抑制CmSAUR66轉(zhuǎn)錄，從而解除對背側(cè)花瓣中CmCYC2c的抑制，促使背腹兩側(cè)花瓣同步伸長，形成管瓣；相反，低生長素水平下CmBES1表達(dá)降低，CmSAUR66去抑制，限制CmCYC2c在背側(cè)的表達(dá)，形成平瓣。有趣的是，CmSAUR66的啟動子同時含有E-box（BR響應(yīng)）和AuxRE（生長素響應(yīng)）元件，這暗示它可能是一個整合生長素和油菜素內(nèi)酯（BR）兩大激素信號的樞紐基因。

圖6 生長素通過CmBES1-CmSAUR66模塊調(diào)控舌狀花發(fā)育的工作模型

該研究不僅填補(bǔ)了早期合瓣花冠筒形成的遺傳機(jī)制空白，更為菊花花型的精準(zhǔn)設(shè)計育種提供了關(guān)鍵靶點(diǎn)。團(tuán)隊已在多種菊花品種中驗證了CmSAUR66表達(dá)水平與花型之間的相關(guān)性，未來可通過基因編輯或分子標(biāo)記輔助選擇，定向培育不同花型的菊花新品種，滿足切花、盆栽和園林綠化等多樣化市場需求。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院博士研究生賈棣文為論文共同第一作者，丁蓮副教授和陳發(fā)棣教授為共同通訊作者。蔣甲福教授、陳素梅教授、蘇江碩副教授等團(tuán)隊成員共同參與了研究工作。該工作得到了國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目及中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金等資助。

論文鏈接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2527961123