在實驗中經(jīng)常需要檢測細胞的凋亡情況，這里總結(jié)了幾種常見的凋亡檢測方法，希望能夠幫到你。

一：細胞凋亡的形態(tài)學檢測

發(fā)生凋亡的細胞在形態(tài)上有一定的特征。

光學顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。

常用的 DNA 特異性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258），DAPI。三種染料與 DNA 的結(jié)合都是非嵌入式的，主要結(jié)合在 DNA 的 A-T 堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。

Hoechst 是與 DNA 特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度，使用時用 PBS 稀釋，終濃度為 10 μg/ml。

DAPI 為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度，使用終濃度一般為 10 μg/ml。

結(jié)果評判

細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變分為三期：Ⅰ 期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa 期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb 期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（圖 1）。

透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評判

凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa 期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體（圖 2）。

二：Annexin V 法

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS 可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中（圖 3）。Annexin-V 是一種分子量為 35~36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與 PS 高親和力特異性結(jié)合。將 Annexin-V 進行熒光素（FITC、PE）或 biotin 標記，以標記了的 Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。

方法

懸浮細胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 標記的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，室溫避光 30 min，再加入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光反應 5 min 后，加入 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 進行流式細胞術定量檢測（一般不超過 1 h）， 同時以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作為陰性對照。

貼壁培養(yǎng)的細胞染色：先用 0.25% 的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。

爬片細胞染色：同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。

結(jié)果

注意事項

1. 整個操作動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞。

2. 操作時注意避光，反應完畢后盡快在一小時內(nèi)檢測。

三：線粒體膜勢能的檢測

線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位（Δψm）的下降，被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA 斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負性的增高或降低。

方法

將正常培養(yǎng)的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為 Rhodamine 123（1 mM）或終濃度為 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 平衡 30 min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。

注意事項

1. 始終保持平衡染液中 pH 值的一致性，因為 pH 值的變化將影響膜電位。

2. 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四：DNA 片段化檢測

細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì) DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂，形成 50~300 kbp 長的 DNA 大片段，或 180~200 bp 整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜 （DNA ladder）。

細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純 DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的 DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純 DNA 后，用 32P-ATP 和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）標記 DNA，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中 DNA ladder 的形成。

大分子染色體 DNA 片段的測定

細胞凋亡的早期，染色體斷裂成為 50~300 kbp 長的 DNA 大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈 DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性 DNA 的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分 DNA，DNA 像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為「爬行」。因此，細胞凋亡早期產(chǎn)生的 50~300 kbp 長的 DNA 大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。

通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后，大的 DNA 分子便滯留在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA 分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當 DNA 分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA 就可以按其分子量大小分開。

DNA Ladder 測定

方法

收獲細胞（1×107）沉淀→細胞裂解液→13 000 rpm ×5 min→收集上清，加 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，孵育 2 h→蛋白酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 體積 3 mol/l 醋酸鈉和 2.5 倍體積的冷無水乙醇沉淀 DNA，4 °C 過夜→14 000 rpm×15 min→最后將沉淀溶解在 TE buffer 中，加 DNA Loading Buffer→1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色并照相。

結(jié)果

凋亡細胞 DNA 含量的流式細胞計分析

方法

收集細胞→70% 冷乙醇（PBS 稀釋）4 °C 固定過夜→PBS 洗滌，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化 30 min→PI（50 mg/ml）染色，室溫避光 15 min→FACScan 分析 DNA 亞二倍體的形成及細胞周期的變化。

結(jié)果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

優(yōu)點：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五：TUNEL 法

細胞凋亡中，染色體 DNA 雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到 DNA 的 3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。TUNEL 實際上是分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

六：Caspase-3 活性的檢測

Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 Caspase-3 為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32 KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個大亞基（17 KD）和兩個小亞基（12 KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，Caspase-3 的活性明顯下降。

Western blot

分析 Procaspase-3 的活化，以及活化的 Caspase-3 及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等的裂解。

方法

收集細胞→PBS 洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 電泳→硝酸纖維素膜或 PVDF 膜轉(zhuǎn)移→5% 脫脂奶粉封閉，室溫 1.5~2 h 或 4 °C 過夜→Caspase-3 多抗或單抗室溫反應 1~2 h 或 4 °C 過夜→TBS-T（含 0.05% Tween 20 的 TBS）洗 3 次，5~10 min/次→HRP-標記的羊抗鼠 IgG 或 AP 標記的羊抗鼠 IgG 室溫反應 1~2 h→ TBS-T 洗 3 次， 5~10 min/次→ECL 顯影或 NBT/BCIP 顯色。

結(jié)果

熒光分光光度計分析

活化的 Caspase-3 能夠特異切割 D1E2V3D4-X 底物，水解 D4-X 肽鍵。根據(jù)這一特點，設計出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯(lián)時，AMC 不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出 AMC，自由的 AMC 才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的 AMC 熒光強度的大小，可以測定 Caspase-3 的活性，從而反映 Caspase-3 被活化的程度。

方法

收獲細胞正常或凋亡細胞→PBS 洗滌→制備細胞裂解液→加 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 四肽熒光底物）→37 °C 反應 1 h→熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發(fā)光波長 380 nm，發(fā)射光波長為 430~460 nm）。

結(jié)果

流式細胞術分析

方法

收獲細胞正常或凋亡細胞→PBS 洗滌→加 Ac-DEVD-AMC→37°C 反應 1 h→UV 流式細胞計分析 Caspase-3 陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。

結(jié)果

七：TFAR19 蛋白表達和細胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報道的一個擁有自己知識產(chǎn)權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的 TFAR19 單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中 TFAR19 蛋白的表達水平及定位研究發(fā)現(xiàn)，凋亡早期 TFAR19 表達水平增高并出現(xiàn)快速核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，伴隨著細胞核形態(tài)學的變化，持續(xù)較長時間，在凋亡小體中仍然可見。

同時我們發(fā)現(xiàn)，凋亡早期 TFAR19 蛋白的核轉(zhuǎn)位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核 DNA 的片段化，提示 TFAR19 蛋白的核轉(zhuǎn)位是細胞凋亡更早期發(fā)生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期 TFAR19 的核轉(zhuǎn)位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現(xiàn) TFAR19 高表達和核轉(zhuǎn)位。這為研究細胞凋亡早期所發(fā)生的事件，提供了一種新的技術和指標。

TFAR19 蛋白的細胞定位分析

材料試劑

FITC 標記的單克隆抗體，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 含 0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 含 2% 胎牛血清及 0.1% NaN3），F(xiàn)ACS 管，Tip 頭，移液器。

儀器

低溫水平離心機，37 °C 水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞儀。

方法

1. 懸浮細胞的染色

（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1×106），PBS 洗 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 洗 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）加入 PBS-T 溶液，37 °C 孵育 15 min，PBS 洗 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）加入 200 ml 胎牛血清，室溫反應 30 min。

（5）加入 5 ml FITC 標記的 TFAR19 單抗（終濃度為 1:40），4 °C 反應 30 min。

（6）熒光細胞洗液洗 2 次，1 000 rpm×10 min。

將細胞沉淀滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察 TFAR19 在細胞中的定位。同時用流式細胞儀定量檢測 TFAR19 蛋白的平均熒光強度。

2. 貼壁細胞的原位染色

（1）貼壁生長的對數(shù)期細胞鋪在 24 孔或 6 孔板中（內(nèi)有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到 50%~80 %滿時，凋亡誘導劑處理細胞。

（2）將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。

（3）將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油（5 ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 TFAR19 在細胞中的定位。

3. 臨床病理切片的染色、檢測

4. 原代細胞的培養(yǎng)、檢測

5. 分析 TFAR19 蛋白在人體內(nèi)各組織器官的分布及定位

TFAR19 蛋白的表達與臨床疾病

ELISA 法檢測正常人和疾病狀態(tài)下，以及疾病的不同時期，血清中 TFAR19 蛋白水平及其 TFAR19 自身抗體水平。

材料和試劑

1. 包被 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸鹽 Buffer

2. 洗滌液： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 含 0.05% Tween 20

3. 封閉液： 3% BSA（用洗滌液配制）

4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋

5. OPD 底物 Buffer：Na2HPO4·12 H2O 1.84 g，檸檬酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 顯色液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：底物 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 終止液 2 mol/L H2SO4

8. 重組人 TFAR19，HRP 標記的羊抗人 IgG9 ELISA 板，Tip，移液器，ELISA Reader（OD 490 nm），洗板機

操作步驟

1. 用包被 Buffer 稀釋的重組人 TFAR19（1 mg/ml）包被 ELISA 板，100 ml/well，37 °C 孵育 2 h 或 4 °C 過夜（一般 24 h 以上）。

2. 洗滌 Buffer 洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37 °C 孵育 2 h 或 4 °C過夜。

3. 洗滌 Buffer 洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3 個重復孔）100 ml/well ，37 °C 孵育 1 h。設包被 Buffer、洗滌 Buffer 、封閉液為陰性對照。

4. 洗滌 Buffer 洗板三次，加入 1:2 500 稀釋的 HRP 標記的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 孵育 1 h。

5. 洗滌 Buffer 洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應 10~15 min。

6. 加入 H2SO4 終止反應，50 ml/well。

7. ELISA Reader 讀取 OD 490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中 TFAR19 自身抗體的表達水平。

8. Western blot 分析原發(fā)性腫瘤細胞和正常細胞的 TFAR 19 蛋白的表達水平。

參考文獻

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

文章來源：丁香園站友 midas

圖片來源：丁香園站友 midas

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