摘要

腹主動(dòng)脈瘤 （AAA） 的臨床治療尚無(wú)藥物治療。主動(dòng)脈炎癥是AAA的重要致病機(jī)制之一，中草藥中的活性成分小檗堿具有抗炎生物學(xué)作用。本研究首先發(fā)現(xiàn)小檗堿治療可以顯著抑制豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌福≒PE）輸注誘導(dǎo)的主動(dòng)脈炎癥、平滑肌細(xì)胞（SMC）耗竭和彈性蛋白降解，并最終改善小鼠實(shí)驗(yàn)性AAA。結(jié)合生物信息學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)和分子對(duì)接技術(shù)，篩選出Runx2、Vcam-1和Ccl2作為小檗堿抑制AAA的可能樞紐基因。Runx2 的 SMC 特異性敲除也顯著減弱了 PPE 誘導(dǎo)的 AAA。因此，小檗堿具有抗AAA作用，可能與其保護(hù)內(nèi)側(cè)SMCs和彈性蛋白有關(guān)，與陽(yáng)性血管重塑和抑制主動(dòng)脈炎癥相關(guān)，因此小檗堿可能是改善AAAs的潛在藥物之一。

圖文簡(jiǎn)介

圖1.小檗堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2.小檗堿治療抑制了小鼠實(shí)驗(yàn)性AAA的進(jìn)展。（A）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：三組小鼠通過(guò)灌胃接受不同劑量的小檗堿：載體組（等體積的生理鹽水）、低劑量小檗堿組（150 mg/kg/天）和高劑量小檗堿組（150 mg/kg/天）。（B） PPE 輸注后第 0、7 和 14 天腎下主動(dòng)脈的代表性超聲圖像。（C）三組小鼠PPE輸注后第0、7、14天腎下主動(dòng)脈直徑的變化和比較。進(jìn)行參數(shù)雙向方差分析，然后進(jìn)行多組比較。（D）接受H&E，EVG和SMC染色的主動(dòng)脈的代表性組織學(xué)圖像。（E、F）彈性蛋白降解和 SMC 耗竭的半定量評(píng)分（中位數(shù)以及第 25 和第 75 個(gè)四分位數(shù)）。在進(jìn)行非參數(shù) Kruskal\u2012Wallis 檢驗(yàn)后，進(jìn)行 Dunn 多重比較檢驗(yàn)。N = 10只小鼠/組;NS，不顯著;* 表示 p < 0.05;**表示p<0.01。

圖3.小檗堿抑制了PPE誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈炎癥和異常血管生成。（A）代表性免疫組織化學(xué)圖像顯示，小檗堿治療改善了PPE誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。（B）主動(dòng)脈壁巨噬細(xì)胞積累的半定量分析，根據(jù)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度評(píng)分為I-IV級(jí)。在載體組中，巨噬細(xì)胞評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)過(guò)于集中，無(wú)法顯示四分位距條;我們?cè)谶@里顯示中位數(shù)和范圍。（C-E）定量分析浸潤(rùn)腹主動(dòng)脈壁的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞以及每個(gè) ACS 中陽(yáng)性染色細(xì)胞的數(shù)量。（F）每個(gè)小檗堿治療組MMP-2和MMP-9免疫染色和主動(dòng)脈壁異常新生血管形成的代表性組織學(xué)圖像。（G、H）MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平以及每個(gè)ACS中新血管密度的定量。對(duì)巨噬細(xì)胞分級(jí)（B）進(jìn)行了非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Dunn多重比較檢驗(yàn)，而對(duì)其他白細(xì)胞亞群（C、D、E、G、H）進(jìn)行了參數(shù)單因素方差分析，然后進(jìn)行了多重比較檢驗(yàn)。N = 10只小鼠/組;NS，不顯著;* 表示 p < 0.05;**表示p<0.01。

圖4.初步篩選揭示了小檗堿與 AAA 小鼠氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。（A-B）GSE232911 DEGs的火山圖和熱力圖。（C）DEGs和OS的維恩圖，鑒定出112個(gè)與OS相關(guān)的DEG。（DEGs，GSE232911中差異表達(dá)的基因;OS，從 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的氧化應(yīng)激基因集）。（D）正常主動(dòng)脈對(duì)照和GSE232911 AAA樣本中22種免疫細(xì)胞亞型的相對(duì)豐度。（E）最佳軟閾值功率確定為8（無(wú)刻度R2=0.9）。（F）WGCNA聚類樹(shù)狀圖產(chǎn)生13個(gè)模塊。（G）13個(gè)模塊與不同免疫細(xì)胞的相關(guān)結(jié)果。（H）DEGs-OS、WGCNA鑒定的強(qiáng)相關(guān)模塊基因和預(yù)測(cè)小檗堿靶點(diǎn)的交集分析，產(chǎn)生19個(gè)核心基因。（I）使用條形圖可視化了19個(gè)核心基因的GO富集分析結(jié)果。（J）使用氣泡圖可視化了19個(gè)核心基因的KEGG通路分析結(jié)果。

圖5.篩選 RUNX2 作為小檗堿影響 AAA 的樞紐基因。（A） BBR和AAA目標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)。（B）使用cytoHubba插件篩選前10個(gè)樞紐基因。直方圖代表MCC方法的cytoHubba評(píng)分，折線圖代表度數(shù)。（C-D）LASSO 回歸模型。（E-F）隨機(jī)森林模型。（G-H）SVM-RFE 模型。（I）利用3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法通過(guò)維恩圖的交集來(lái)識(shí)別核心基因。（J-K）評(píng)估了GSE232911和GSE183464數(shù)據(jù)集中核心基因的ROC曲線，曲線下面積作為評(píng)估診斷測(cè)試性能的指標(biāo)。（l）RUNX2基因在GSE232911和GSE183464數(shù)據(jù)集中的表達(dá)水平。GSE232911，來(lái)自 76 名 AAA 患者和 13 名器官捐獻(xiàn)者對(duì)照的樣本。GSE183464，來(lái)自 7 名 AAA 患者和 7 名對(duì)照個(gè)體的主動(dòng)脈樣本。使用學(xué)生 t 檢驗(yàn)。NAC，正常主動(dòng)脈控制;** 表示 p < 0.01。（M）GSE232911中RUNX2的基因集富集分析（GSEA）。（N）小檗堿與RUNX2的分子對(duì)接。

圖6.SMC 中的 Runx2 缺乏改善了小鼠的實(shí)驗(yàn)性 AAA。（A）實(shí)驗(yàn)方案：野生型小鼠和Runx2?SMC小鼠都輸注PPE以誘導(dǎo)AAA形成。（B） PPE 輸注后第 0 天和第 14 天腎下主動(dòng)脈的代表性超聲圖像。（C） PPE 輸注后第 0 天和第 14 天腎下主動(dòng)脈直徑的比較。（D）與基線相比，PPE輸注后兩組小鼠主動(dòng)脈直徑增加的百分比。（E）H&E，EVG和SMC染色的代表性組織學(xué)圖像。（F-G）彈性蛋白降解和 SMC 損失的半定量評(píng)分（中位數(shù)和第 25 和第 75 個(gè)四分位數(shù)）。進(jìn)行雙向方差分析 （C）、學(xué)生 t 檢驗(yàn) （D） 或非參數(shù) Mann\u2012Whitney 檢驗(yàn) （F， G）。N = 10 只小鼠/組，** 表示 p < 0.01。

圖7.SMCs中Runx2缺乏對(duì)AAA免疫病理特征的影響。（A）主動(dòng)脈炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的代表性圖像。（B）AAA病灶巨噬細(xì)胞積累的半定量分析。（C-E）分析 AAA 病變每個(gè)橫截面中陽(yáng)性染色的白細(xì)胞亞群數(shù)量。（F）AAA病變中MMP-2和MMP-9免疫染色和CD31陽(yáng)性新生血管的代表性圖像。（G-H）比較 MMP-2 和 MMP-9 的表達(dá)水平并分析 AAA 病灶中異常血管生成。通過(guò)非參數(shù) Mann\u2012Whitney 檢驗(yàn) （B） 或?qū)W生 t 檢驗(yàn) （C、D、E、G、H） 分析數(shù)據(jù)。N = 10 只小鼠/組，** 表示 p < 0.01。

圖8.小檗堿對(duì)實(shí)驗(yàn)性 AAA 的治療效果。

結(jié)論

綜上所述，本研究首次報(bào)道小檗堿治療抑制了PPE誘導(dǎo)的主動(dòng)脈炎癥，內(nèi)側(cè)SMC耗竭和彈性蛋白降解，并最終改善了小鼠的實(shí)驗(yàn)性AAA。Runx2 被確定為一種可能的樞紐基因，小檗堿通過(guò)該基因結(jié)合生物信息學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)和分子對(duì)接技術(shù)來(lái)抑制 AAA。Runx2 的 SMC 特異性敲除也顯著減弱了 PPE 誘導(dǎo)的 AAA。因此，小檗堿具有抗動(dòng)脈瘤作用，可能與其對(duì)內(nèi)側(cè)SMCs和彈性蛋白的保護(hù)有關(guān)，這與有益的血管重塑和抑制主動(dòng)脈炎癥有關(guān)。

DOI: 10.1016/j.phymed.2025.157176

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