結(jié)腸癌疾病模型

前言

結(jié)腸癌是發(fā)生于結(jié)腸的消化道惡性腫瘤。不良飲食習(xí)慣、結(jié)直腸息肉、結(jié)腸腺瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸血吸蟲(chóng)病肉芽腫、遺傳等都是結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素。結(jié)腸癌早期常無(wú)特殊癥狀，中后期主要癥狀有排便次數(shù)增加，腹瀉、便秘，糞便中帶血、膿液或黏液，腹痛腹脹，貧血、消瘦乏力、低熱等。晚期癌細(xì)胞可擴(kuò)散到淋巴結(jié)、肝和肺等多個(gè)部位甚至導(dǎo)致死亡。

圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)

01 構(gòu)建方法

一、化學(xué)誘導(dǎo)模型

1. AOM/DSS 聯(lián)合模型（黃金標(biāo)準(zhǔn)）

原理：AOM 通過(guò) DNA 烷化誘發(fā)基因突變，DSS 破壞腸黏膜屏障引發(fā)慢性炎癥，協(xié)同模擬炎癥 - 癌癥轉(zhuǎn)化過(guò)程。

操作步驟：

四步法：6-8 周齡雌性 BALB/c 小鼠（對(duì) AOM 敏感）腹腔注射 AOM（10 mg/kg），1 周后飲用 3% DSS 溶液 1 周，隨后普通飲水 2 周，重復(fù) 3 次循環(huán)，總周期約 8-10 周。

兩步法：AOM 注射后僅進(jìn)行 1 輪 DSS 沖擊，14 天內(nèi)可觀察到早期病理特征，適用于快速藥物篩選。

優(yōu)化要點(diǎn)：AOM 劑量需根據(jù)小鼠品系調(diào)整（C57BL/6N 敏感性低于 BALB/c），DSS 濃度（1%-3%）和循環(huán)次數(shù)影響成瘤率與腫瘤異質(zhì)性。

優(yōu)勢(shì)：成瘤率高（90%+），病理過(guò)程接近人類(lèi)潰瘍性結(jié)腸炎癌變，適合炎癥相關(guān)機(jī)制研究。

參考文獻(xiàn)-劉利,葉映泉,桂仲旋,等.亮菌多糖對(duì)AOM/DSS炎癥相關(guān)性結(jié)腸癌小鼠模型及其腸道菌群的影響

2. DMH 模型

方法：6 周齡 ICR 小鼠腹腔注射 DMH（21 mg/kg，每周 1 次，連續(xù) 20 周），通過(guò)代謝產(chǎn)物甲基氧化偶氮甲醇誘導(dǎo)結(jié)腸腺癌。

局限：致癌周期長(zhǎng)，個(gè)體差異較大，目前逐漸被 AOM 替代。

二、基因工程模型

1. Apc 基因突變模型

經(jīng)典品系：

ApcMin/+小鼠：攜帶Apc基因截短突變，15周齡后小腸多發(fā)腺瘤，但結(jié)腸病變較少，需聯(lián)合DSS或AOM增強(qiáng)結(jié)腸成瘤。

Apc580S 小鼠：通過(guò) Cre-Lox 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)結(jié)腸特異性Apc缺失，腫瘤局限于結(jié)腸，潛伏期短（4-6 周），適合分子機(jī)制研究。

操作關(guān)鍵：選擇 Villin-Cre 或 Muc2-Cre 啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)腸上皮特異性基因編輯，避免全身毒性。

2. 多基因突變模型

Apc/Kras雙突變模型：利用Cre-Lox系統(tǒng)在結(jié)腸上皮同時(shí)敲除Apc并激活 KrasG12V，可誘導(dǎo)侵襲性腺癌，模擬人類(lèi)散發(fā)性結(jié)腸癌。

優(yōu)勢(shì)：腫瘤微環(huán)境和分子特征更接近臨床樣本，適合靶向藥物開(kāi)發(fā)。

三、移植模型

1. 細(xì)胞系移植模型

皮下移植：

CT26 細(xì)胞：BALB/c小鼠右側(cè)腋下注射5×10?個(gè)細(xì)胞（懸浮于0.2 mL PBS），10-14天形成可觸及瘤體，適合藥物療效初篩。

MC38 細(xì)胞：C57BL/6 小鼠皮下注射后可自發(fā)肺轉(zhuǎn)移，用于轉(zhuǎn)移機(jī)制研究。

參考文獻(xiàn)-Ruli Li a, Rongrong Wang b,The antitumor effects of lupenone on colon cancer and itsmechanistic insights

原位移植：

結(jié)腸注射：麻醉后暴露結(jié)腸，將CT26 細(xì)胞（5×10?個(gè)/50 μL）注射至腸壁，可模擬原發(fā)腫瘤微環(huán)境，轉(zhuǎn)移率顯著高于皮下移植。

2. PDX 模型（患者來(lái)源異種移植）

操作流程：

組織獲取：手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織需在 30 分鐘內(nèi)處理，切成 1 mm3 小塊。

移植方法：腎包膜下或結(jié)腸原位移植至NOD/SCID或NSG小鼠，基質(zhì)膠（Matrigel）包裹可提高成瘤率。

篩選驗(yàn)證：通過(guò) HE 染色和免疫組化確認(rèn)腫瘤異質(zhì)性，傳代3代以上穩(wěn)定后用于實(shí)驗(yàn)。

優(yōu)勢(shì)：保留患者腫瘤的遺傳特征和藥物反應(yīng)，臨床相關(guān)性高達(dá)89%。

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02 文獻(xiàn)分享

參考文獻(xiàn)：The antitumor effects of lupenone on colon cancer and itsmechanistic insights

中文翻譯：羽扇豆醇酮對(duì)結(jié)腸癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究

期刊：《PHYTOMEDICINE》 ( IF 8.3/Q1 )

背景：羽扇豆酮是一種來(lái)源于藥用植物和水果的天然成分，屬于羽扇豆烷型三萜類(lèi)化合物，以其多樣的生物活性而聞名，包括抗糖尿病、抗癌和抗炎作用。然而，羽扇豆酮對(duì)結(jié)腸癌的具體影響尚未完全闡明。

目的：本研究旨在探討羽扇豆酮單藥治療以及與化療藥物聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌的抗癌作用。

方法：在體外研究中，采用CCK8法和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羽扇豆酮對(duì)CT26和MC38結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。通過(guò)Ki67染色評(píng)估羽扇豆酮的抗增殖特性，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羽扇豆酮的抗遷移作用。分別采用活細(xì)胞探針和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（實(shí)時(shí)PCR）檢測(cè)活性氧（ROS）水平和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激通路。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光染色評(píng)估自噬及自噬流。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，在CT26荷瘤小鼠模型中進(jìn)一步研究了羽扇豆酮單藥治療及與順鉑聯(lián)合使用的抗腫瘤效果。通過(guò)腫瘤體積和蛋白表達(dá)評(píng)估抗腫瘤 efficacy，同時(shí)通過(guò)組織學(xué)染色評(píng)估羽扇豆酮的安全性。通過(guò)RNA測(cè)序闡明羽扇豆酮與順鉑聯(lián)合使用的作用機(jī)制。

結(jié)果顯示：羽扇豆醇酮（Lupenone）可呈濃度依賴性顯著抑制 CT26 和 MC38 結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)減少細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，羽扇豆醇酮可升高結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，且誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）具有 ROS 依賴性。不僅如此，羽扇豆醇酮能觸發(fā)細(xì)胞自噬但抑制自噬流，從而發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用，而自噬抑制劑 3 - 甲基腺嘌呤（3MA）可減弱該作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示，羽扇豆醇酮具有與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）結(jié)合的潛力；且 mTOR 激活劑 MHY1485 可部分逆轉(zhuǎn)羽扇豆醇酮誘導(dǎo)的自噬效應(yīng)。另外，清除 ROS 或抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，均能在一定程度上逆轉(zhuǎn)羽扇豆醇酮對(duì)自噬的調(diào)控作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，羽扇豆醇酮可抑制（小鼠）皮下腫瘤生長(zhǎng)，且未導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯體重下降或主要器官損傷。羽扇豆醇酮與順鉑（cisplatin）聯(lián)合治療時(shí)，抗腫瘤效果顯著增強(qiáng)；RNA 測(cè)序分析結(jié)果顯示，該聯(lián)合治療可調(diào)控癌細(xì)胞代謝、T 細(xì)胞分化與活化、細(xì)胞外基質(zhì)重塑及免疫炎癥微環(huán)境。

結(jié)論：本研究表明，羽扇豆醇酮單藥治療可抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)，且對(duì)主要器官無(wú)毒性；而羽扇豆醇酮與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，可增強(qiáng)化療藥物的抗癌效果。這些研究結(jié)果凸顯了羽扇豆醇酮作為新型結(jié)腸癌治療藥物的潛在價(jià)值。

羽扇豆醇酮治療結(jié)腸癌的機(jī)制

1、羽扇豆醇酮以濃度依賴的方式誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞死亡。

2、羽扇豆醇酮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

3、羽扇豆醇酮觸發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

4、羽扇豆醇酮可阻止結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。

5、羽扇豆醇酮增加了ROS，并觸發(fā)了結(jié)腸癌細(xì)胞的ER應(yīng)激。

6、羽扇豆醇酮觸發(fā)了自噬，并損害了結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬通量。

7、羽扇豆醇酮通過(guò)抑制mTOR在結(jié)腸癌細(xì)胞中觸發(fā)自噬。

8、羽扇豆醇酮引發(fā)ROS-ER應(yīng)激級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而激活自噬。

9、羽扇豆醇酮在小鼠皮下腫瘤模型中抑制了腫瘤生長(zhǎng)

10、羽扇豆醇酮與順鉑聯(lián)用可增強(qiáng)對(duì)結(jié)腸癌的抗腫瘤作用

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