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Introduction

衰老是隨著時(shí)間的推移不可避免的生理退化過(guò)程，伴隨腦功能的下降，表現(xiàn)為氧化應(yīng)激增加、神經(jīng)元丟失、神經(jīng)傳導(dǎo)下降、記憶下降等。研究表明，活性氧（ROS）的過(guò)度產(chǎn)生觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是神經(jīng)元退行性變微環(huán)境的主要驅(qū)動(dòng)力。近年來(lái)，納米材料設(shè)計(jì)策略已廣泛用于退行性神經(jīng)元的靶向干預(yù)?？紤]到工程納米復(fù)合物的生物相容性差、腦血比低、ROS清除不足、合成困難和尺寸大等一系列問(wèn)題，迫切需要一種快速且可代謝的合成策略，用于腦蓄積和有效的ROS消除。

天然抗氧化藥物在復(fù)雜發(fā)病機(jī)制的長(zhǎng)期干預(yù)過(guò)程中可以提高患者的免疫力。其中，番茄紅素（LYC）作為高效抑制單線態(tài)氧（1O2）的類(lèi)胡蘿卜素，可抑制氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥和線粒體損傷。然而，LYC的低生物利用度和血腦屏障的低通透性限制了其在神經(jīng)元中的有效性，使合適的載體成為保護(hù)和豐富它的必要條件，以放大其在大腦中的功能。理想的納米遞送平臺(tái)應(yīng)具有較高的循環(huán)穩(wěn)定性，便于將載藥靶向遞送到特定部位并以優(yōu)異的生物相容性被神經(jīng)元吸收。與此同時(shí)，得益于納米顆粒的保護(hù)屏障和遞送，親脂性分子的水溶性和穩(wěn)定性提高，使其對(duì)神經(jīng)元更有效。

本研究以重組人H-鐵蛋白納米籠（rHuHF）為最佳載體構(gòu)建天然抗氧化rHuHF-LYC納米粒。通過(guò)異源表達(dá)獲取rHuHF載體，將LYC分子裝入rHuHF的穩(wěn)定空腔內(nèi)，通過(guò)分子模擬結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究rHuHF與LYC的相互作用。通過(guò)BBB跨細(xì)胞模型、亞細(xì)胞熒光定位及rHuHF-LYC的抗氧化活性驗(yàn)證rHuHF-LYC的神經(jīng)功能改善作用。rHuHF-LYC為腦保護(hù)和抗衰老提供了有效的策略。

Results and Discussion

rHuHF-LYC納米顆粒的構(gòu)建與表征

純化的rHuHF（約480 kDa）僅由約20 kDa的一個(gè)亞單位形成（圖1C），由于LYC的大小（長(zhǎng)33.3 ?，寬10.9 ?）遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了rHuHF表面的通道（3～4 ?），LYC被rHuHF包裹在其內(nèi)部腔內(nèi)并穩(wěn)定存在（圖1A）。在此情況下，包封率和載藥率分別為60.64%和6.06%（圖1B），即LYC/rHuHF的平均顆粒比平均為56∶1，遠(yuǎn)高于姜黃素、蘆丁、β-胡蘿卜素等脂溶性物質(zhì)。此外，rHuHF水溶液清澈透明，rHuHF-LYC溶液呈均勻鮮紅色，游離的LYC呈固體顆粒懸浮（圖1B）。納米粒子仍然具有良好的納米籠形態(tài)和均勻的直徑（圖1D），納米籠尺寸的輕微擴(kuò)展解釋了它們的尺寸靈活性，不同的是，內(nèi)化的LYC顯著干擾rHuHF腔內(nèi)鐵的氧化成核。因此，當(dāng)對(duì)蛋白球進(jìn)行透射電子顯微鏡（TEM）成像時(shí)，更多的黑乙酸鈾進(jìn)入了rHuHF-LYC的腔內(nèi)（圖1E）。這表明LYC分子成功插入到rHuHF腔中，并伴隨著LYC溶解度的巨大變化。包封有利于LYC分子在外界體系中的穩(wěn)定，剛性rHuHF納米籠包埋后二級(jí)結(jié)構(gòu)和粒徑?jīng)]有變化（圖1F和圖G），為負(fù)載的LYC分子提供物理屏障和化學(xué)穩(wěn)定作用。

圖1 rHuHF-LYC納米顆粒的構(gòu)建與表征

LYC與其蛋白籠的相互作用使LYC分子穩(wěn)定

由于LYC的易降解性和較強(qiáng)的抗氧化能力在保健功能食品中廣泛應(yīng)用，因此需要提高其穩(wěn)定性以防止其生物學(xué)特性的喪失。剛性的rHuHF納米籠穩(wěn)定了LYC分子，作為保護(hù)屏障阻擋了外部系統(tǒng)的影響因素，rHuHF-LYC的熱穩(wěn)定性和抗氧化能力相比于游離的LYC都有很大的改善（圖2A和B）。熱降解動(dòng)力學(xué)的回歸系數(shù)（R2）分別為0.9558（LYC）和0.9945（rHuHF-LYC），表明LYC的降解保留量與反應(yīng)時(shí)間具有良好的相關(guān)性。當(dāng)降解速度減慢時(shí)，rHuHF-LYC納米粒子中的LYC含量穩(wěn)定在初始水平的85%左右，而游離LYC組在7 h時(shí)的LYC含量?jī)H為78%，表明rHuHF的包封增強(qiáng)LYC的熱穩(wěn)定性。此外，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)60 min時(shí)，rHuHF-LYC組對(duì)DPPH的抑制作用顯著增強(qiáng)（P＜0.01），遠(yuǎn)高于游離LYC對(duì)照組。結(jié)果表明，由于殼狀鐵蛋白納米籠的保護(hù)，LYC的抗氧化能力隨著時(shí)間的推移保持良好。結(jié)果也說(shuō)明了LYC分子與其蛋白籠之間可能存在的相互作用，從而保證了LYC分子的穩(wěn)定性。

通過(guò)分子對(duì)接模擬計(jì)算了LYC分子與其rHuHF納米籠之間的相互作用。高CDOCKER能量（?ECD）表明，LYC的結(jié)合位點(diǎn)位于四重軸通道附近的rHuHF-LYC納米籠的管腔中，由ALA47、LYS49和LYS172組成，形成疏水鍵（圖2C）。這種結(jié)合力可能促進(jìn)了LYC分子成功包封到鐵蛋白納米籠中，從而導(dǎo)致兩者相互作用引起的LYC的穩(wěn)定性和溶解度。此外，通過(guò)ITC測(cè)定了rHuHF和LYC的平衡熱變化及其參數(shù)。原始數(shù)據(jù)的擬合曲線揭示了rHuHF和LYC的結(jié)合（圖2D2）。反應(yīng)的ΔH（焓）、ΔS（熵）、ΔG（未顯示）、結(jié)合常數(shù)Kd和n（表觀結(jié)合化學(xué)計(jì)量）值分別為?1826 kJ/mol、?6 002 J/（mol·K）、?37.4 kJ/mol、4.572×10?7 mol/L和1.193。ΔH和ΔS為負(fù)，表明rHuHF與LYC之間存在良好的非共價(jià)相互作用。因此，結(jié)合反應(yīng)可以是非特異性的、放熱的（ΔH＜0）和自發(fā)的（ΔG＜0）結(jié)合反應(yīng)。以上結(jié)果表明，將LYC包封到rHuHF納米籠中可以通過(guò)相互作用提高LYC的穩(wěn)定性和溶解度。

圖2 rHuHF-LYC納米粒子的穩(wěn)定性與相互作用分析

血腦屏障的胞吞作用和神經(jīng)元靶向能力的評(píng)估

rHuHF通過(guò)內(nèi)源性受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮最佳納米載體的作用，而TfR1在血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，允許rHuHF通過(guò)內(nèi)體室跨血腦屏障轉(zhuǎn)移。為了驗(yàn)證rHuHF-LYC納米復(fù)合物對(duì)血腦屏障的穿透，進(jìn)行了血腦屏障跨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在確認(rèn)FITC-rHuHF-LYC不影響細(xì)胞存活的基礎(chǔ)上，將其添加到人或小鼠血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞的上腔（圖3A和B）。FITC-rHuHF-LYC顯著穿過(guò)人或小鼠BBB內(nèi)皮細(xì)胞，而FITC-LFn（對(duì)照人L-鐵蛋白）則沒(méi)有。在1 h內(nèi)，hCMEC/D3細(xì)胞幾乎是FITC-LFn的5倍（P < 0.001）（圖3C和D）。2 h后，較低的PC12細(xì)胞對(duì)FITC-rHuHF-LYC的吸收顯著增加（P < 0.001）（圖3E和圖3f）。此外，F(xiàn)ITC-rHuHF-LYC和溶酶體的熒光共成像顯示其非共定位，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為?0.11和0.16，表明FITC-rHuHF-LYC在BBB ECs中沒(méi)有被吸收，而是被轉(zhuǎn)運(yùn)（圖3G）。這些結(jié)果表明rHuHF-LYC能夠在體外穿過(guò)血腦屏障。此外，F(xiàn)ITC-rHuHF-LYC被PC12細(xì)胞明顯吸收并與溶酶體共定位（圖3H和J），Pearson相關(guān)系數(shù)為0.73（圖3I），說(shuō)明FITC-rHuHF-LYC可以進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞。這與BBB ECs transwell的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果一致，共同證明了FITC-rHuHF-LYC可被神經(jīng)細(xì)胞吸收。

圖3 rHuHF-LYC穿越血腦屏障并被神經(jīng)細(xì)胞攝取

rHuHF-LYC納米顆粒作為神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS清除劑的研究

在神經(jīng)元微環(huán)境中，氧化損傷先于神經(jīng)病理的發(fā)生，導(dǎo)致線粒體進(jìn)一步損傷，甚至認(rèn)知功能下降。一些研究強(qiáng)調(diào)了基于D-半乳糖（D-gal）的誘導(dǎo)腦衰老和神經(jīng)元凋亡模型。在此，培養(yǎng)BV2和PC12細(xì)胞，研究rHuHF-LYC對(duì)D-gal誘導(dǎo)損傷的過(guò)氧化緩解作用。500 mmol/L D-gal可使BV2和PC12細(xì)胞達(dá)到IC50，加入rHuHF-LYC以劑量依賴性方式顯著降低PC12細(xì)胞中的ROS水平（P＜0.05），這優(yōu)于單獨(dú)加入rHuHF（圖4A）。此外，在PC12細(xì)胞中驗(yàn)證了rHuHF-LYC對(duì)細(xì)胞內(nèi)SOD活性的調(diào)節(jié)（圖4B），20 μg/mL及以上的rHuHF-LYC顯著減弱了D-gal誘導(dǎo)的SOD活性下降（P＜0.05）。同樣，D-gal誘導(dǎo)的PC12和BV2細(xì)胞的強(qiáng)ROS信號(hào)減弱，rHuHF-LYC處理后逐漸接近對(duì)照組的熒光強(qiáng)度（圖4C、E、F），也減輕了BV2和PC12細(xì)胞的形態(tài)皺縮和凋亡傾向（圖4D）。這些結(jié)果表明，rHuHF-LYC納米粒子減弱了D-gal誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)。

圖4 rHuHF-LYC對(duì)D-gal誘導(dǎo)的BV2和PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

此外，rHuHF-LYC顯著減輕了BV2和PC12細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)為線粒體膜電位和磷脂酰絲氨酸外翻的變化（圖5A）。熒光成像和定量分析顯示，rHuHF-LYC的加入有利于維持完整的細(xì)胞形態(tài)（粉色和藍(lán)色），減少碎片或凋亡（綠色），維持細(xì)胞黏附。rHuHF-LYC以劑量依賴性方式顯著抑制凋亡PC12細(xì)胞的數(shù)量（圖5B）。因此，在D-gal干擾下，BV2細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用減弱，而rHuHF-LYC在修復(fù)這些不良變化的同時(shí)，起到了直接保護(hù)神經(jīng)元的作用。乙酰膽堿酯酶（AChE）和乙酰膽堿酯酶（ACh）是膽堿能系統(tǒng)的關(guān)鍵物質(zhì)，在評(píng)價(jià)神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)方面具有重要作用。rHuHF-LYC顯著抑制了D-gal損傷后BV2和PC12細(xì)胞中AChE活性的增加和ACh活性的降低（P＜0.05），減輕了D-gal誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞興奮性降低或終止（圖5C和D）。這些結(jié)果表明，納米粒子通過(guò)維持抗氧化防御和線粒體功能在保護(hù)BV2和PC12細(xì)胞中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

圖5 通過(guò)rHuHF-LYC治療減輕線粒體膜電位丟失和神經(jīng)元凋亡

通過(guò)rHuHF-LYC調(diào)控PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)特征性的促/抗凋亡和衰老相關(guān)蛋白（圖6），免疫印跡結(jié)果顯示，與模型組相比，rHuHF-LYC納米粒顯著上調(diào)Bcl-xL和Bcl-2的表達(dá)（P＜0.05），下調(diào)p-AKT、Bad、Bax、cleaved caspase-3和p53的表達(dá)（P＜0.05）。rHuHF-LYC處理PC12細(xì)胞后，下調(diào)p-AKT水平引起線粒體介導(dǎo)的Bcl-xL/Bad值升高和Bax/Bcl-2降低。最后，rHuHF-LYC可顯著下調(diào)cleaved caspase-3和p53的表達(dá)（P＜0.05），從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。rHuHF-LYC通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，減緩PC12細(xì)胞的神經(jīng)元凋亡。

圖6 Western blot分析rHuHF-LYC對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Conclusion

綜上所述，具有清除神經(jīng)活性氧能力的rHuHF-LYC納米粒通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元和改善神經(jīng)微環(huán)境表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。rHuHF-LYC通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑穿過(guò)血腦屏障并內(nèi)化到神經(jīng)元內(nèi)。隨后，PC12和BV2細(xì)胞的過(guò)度氧化和線粒體穩(wěn)態(tài)失衡得到緩解。此外，rHuHF-LYC通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，減緩PC12細(xì)胞的神經(jīng)元凋亡。因此，rHuHF-LYC納米顆粒抑制了不良神經(jīng)微環(huán)境的發(fā)展，為對(duì)抗大腦衰老提供了一種有前景的治療選擇。

第一作者

夏小雨，女，工學(xué)博士，現(xiàn)為廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院講師。研究方向?yàn)樨愵?lèi)蛋白構(gòu)效關(guān)系及功能機(jī)制、靶向型生物納米材料的功能營(yíng)養(yǎng)精準(zhǔn)遞送。曾獲博士國(guó)家獎(jiǎng)學(xué)金、2024屆遼寧省優(yōu)秀博士畢業(yè)生、大連工業(yè)大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文。參與貝類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、湛江市科技計(jì)劃等多個(gè)項(xiàng)目，以第一作者在ACS Nano、FSHW和JAFC等期刊發(fā)表論文9篇，參編著作1部，獲授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利3件。

通信作者

杜明，教授，大連海洋大學(xué)校長(zhǎng)，博士研究生導(dǎo)師，大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院/國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心朱蓓薇院士團(tuán)隊(duì)“蛋白質(zhì)科學(xué)與技術(shù)”研究方向負(fù)責(zé)人。入選國(guó)家萬(wàn)人計(jì)劃科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才、科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才、教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才。兼任國(guó)務(wù)院食品與營(yíng)養(yǎng)專(zhuān)業(yè)學(xué)位研究生教育指導(dǎo)委員會(huì)委員、遼寧省食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)；學(xué)術(shù)兼職包括Food Frontiers、Food Science and Human Wellness、Protein and Peptide Letters、《食品科學(xué)》、《食品工業(yè)科技》、《食品工研究與開(kāi)發(fā)》、《大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》等期刊編委。主要從事研究領(lǐng)域：（1）食源性蛋白構(gòu)效關(guān)系及活性機(jī)制；（2）專(zhuān)用功能性蛋白質(zhì)配料加工技術(shù)；（3）民族特色食品加工及產(chǎn)業(yè)化。主持國(guó)家十四五重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目、國(guó)家十三五重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目等多項(xiàng)課題。作為主要完成人獲省部級(jí)科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)和二等獎(jiǎng)各2項(xiàng)，省部級(jí)科技發(fā)明二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，國(guó)家教學(xué)成果二等獎(jiǎng)1項(xiàng)。在Nature Communications、ACS nano、Chemical Engineering Journal等期刊以第一或通訊身份發(fā)表論文170余篇，論文總引用次數(shù)6400余次，H-index 43；參編《Mineral Containing Proteins》，《Biologically Active Peptides》等著作13部；制定“蛋白質(zhì)基食品”相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)3項(xiàng)，第一發(fā)明人授權(quán)國(guó)家發(fā)明19項(xiàng)。

Ferritin nanocage loading lycopene for improving blood-brain barrier transcytosis and attenuating D-galactose-induced apoptosis in PC12 cells

Xiaoyu Xiaa,b,c, Han Lia,b,c, Xianbing Xua,b,c, Zhenyu Wanga,b,c, Junjie Yid, Guanghua Zhaoe, Ming Dua,b,c,*

a School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

b Collaborative Innovation Centre of Provincial and Ministerial Co-construction for Seafood Deep Processing, Dalian 116034, China

c National Engineering Research Centre of Seafood, Dalian 116034, China

d Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China

e College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Aging is a physiological process that leads to degeneration and functional decline of the brain. This is accompanied by intracellular peroxidation and neuronal apoptosis. Natural antioxidants possess a remarkable effect on attenuating the oxidative stress cascade and apoptosis of neurons; however, the challenge of using natural antioxidants for neuroprotection is fabricating a delivery system to overcome the blood-brain barrier (BBB) transport. Herein, we successfully created a stable delivery platform built on rigid ferritin nanocage loading natural lycopene molecules, crossing the BBB in quantity and being taken up in neurons. This nanoparticle worked on D-galactose-induced senescence via alleviating neuronal hyperoxidation injury and weakening neuronal apoptosis in PC12 and BV2 cells. More importantly, this natural delivery system possesses inherent biocompatibility and potential application in improving the bioavailability of bioactive edible compounds with low water solubility. This study demonstrated the effectiveness of natural antioxidant nanomedicines in maintaining the defenses of intracerebral peroxidation and improve degenerating neurons, providing the potential to combat further imbalances of neuronal microenvironment in aging neuropathy.

Reference:

XIA X Y, LI H, XU X B, et al. Ferritin nanocage loading lycopene for improving blood-brain barrier transcytosis and attenuating

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編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲(chóng)創(chuàng)意