草魚(yú)（

Ctenopharyngodon idella

）是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)淡水魚(yú)種之一，肉質(zhì)肥厚、脆度高口感好、滋味鮮美；雖活魚(yú)鮮銷(xiāo)價(jià)格低廉，但冷藏生鮮草魚(yú)肉片市場(chǎng)前景看好。近年的研究發(fā)現(xiàn)畜禽動(dòng)物宰后早期的細(xì)胞凋亡是宰后由肌肉走向生鮮肉，形成肉品質(zhì)特征的必然關(guān)鍵過(guò)程之一，與質(zhì)構(gòu)特性關(guān)系密切。

細(xì)胞凋亡是指生物為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因自主控制的一種程序性死亡過(guò)程。初步發(fā)現(xiàn)肌肉細(xì)胞的凋亡與冷藏魚(yú)肉品質(zhì)如剪切力和持水力相關(guān)。小分子的Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制因子中的重要家族成員，是典型的半胱氨酸組織蛋白酶天然抑制因子，在作為魚(yú)類(lèi)加工廢棄物的組織（如碎肉、皮、卵、肝胰腺等）中廣泛分布。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的相關(guān)研究已經(jīng)表明Cystatins可以調(diào)控細(xì)胞凋亡。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院的李龍飛、李樹(shù)紅*、錢(qián)鄧帆等以魚(yú)源Cystatin C注射處理草魚(yú)肉片，在驗(yàn)證Cystatin C細(xì)胞滲透有效性的基礎(chǔ)上，研究宰后冷藏0～72 h期間魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的變化，以及在組織學(xué)水平測(cè)定魚(yú)肉肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時(shí)結(jié)合線粒體損傷情況及線粒體途徑細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3和Caspase-9的活性、蛋白表達(dá)水平，綜合分析探討鰱魚(yú)Cystatin C通過(guò)調(diào)節(jié)宰后早期的肌細(xì)胞凋亡影響魚(yú)肉品質(zhì)形成的潛在關(guān)系。以期為今后從細(xì)胞凋亡調(diào)控的角度，深入闡明Cystatin C在魚(yú)肉片保鮮中的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)并提供一定的理論依據(jù)。

1 HmCystatin C滲透有效性分析

采用Western blot分析HmCystatin C的滲透效果，如圖1所示，向Cys組注射的HmCystatin C，盡管可能由于蛋白的穩(wěn)定性下降或降解，相較注射0 h而言后續(xù)時(shí)間點(diǎn)上均有所減少，但在冷藏72 h內(nèi)持續(xù)存在，且72 h的Con組內(nèi)源Cystatin C有所上升，可能導(dǎo)致了Cys組蛋白檢測(cè)值有所波動(dòng)，但仍略低于12 h值。Carvajal等研究發(fā)現(xiàn)，Cystatin C在注射后的35 min內(nèi)穿過(guò)魚(yú)肉肌纖維細(xì)胞膜并滲透擴(kuò)散到魚(yú)肌肉細(xì)胞膜內(nèi)部。此外，團(tuán)隊(duì)前期關(guān)于HmCystatin C穩(wěn)定性研究也表明4 ℃條件下其活性在21 d內(nèi)仍維持80%。

2 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)特性的影響

剪切力是評(píng)價(jià)魚(yú)肉新鮮度的重要質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，剪切力越低，魚(yú)肉新鮮度越差。由圖2可知，兩組魚(yú)肉的剪切力均在冷藏12 h后不同程度開(kāi)始下降，逐漸發(fā)生軟化；但相對(duì)Con組，Cys組在24 h時(shí)下降并不明顯。此外，72 h的冷藏期內(nèi)，除0 h外Cys組的剪切力均顯著高于Con組（P＜0.05），即便是在48 h兩組剪切力都發(fā)生明顯下降時(shí)亦如此。

質(zhì)構(gòu)結(jié)果如表1所示，冷藏72 h內(nèi)魚(yú)肉片硬度在兩組間的變化趨勢(shì)基本與剪切力一致（

P

＜0.05）。但同時(shí)明顯發(fā)現(xiàn)，與Con組魚(yú)肉硬度在12 h達(dá)到最大值后于24 h開(kāi)始迅速下降相比，Cys組在24 h時(shí)硬度持續(xù)保持最高水平，Cys組48、72 h的硬度基本與Con組24、48 h的硬度相當(dāng)，一方面說(shuō)明HmCystatin C對(duì)肉質(zhì)變化的影響，在24 h左右體現(xiàn)特別明顯，另一方面可知HmCystatin C有助于將草魚(yú)肉片軟化劣變延緩至少24 h。此外，草魚(yú)肉片在冷藏期72 h時(shí)Cys組彈性顯著（

P

＜0.05）高于Con組。

上述結(jié)果提示HmCystatin C對(duì)冷藏魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化確有改善作用，HmCystatin C處理后其質(zhì)構(gòu)品質(zhì)至少能夠多維持12～24 h。

3 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片肌細(xì)胞間隙的影響

凋亡的細(xì)胞會(huì)發(fā)生皺縮，導(dǎo)致相鄰細(xì)胞逐漸分離、間隙增大。由圖3與表2可知，隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，肌細(xì)胞排列出現(xiàn)疏松、間隙逐漸增大的現(xiàn)象；24～72 h時(shí)Con組細(xì)胞間隙均顯著高于Cys組（

P

＜0.05），Xiong Xin等的研究表明，凋亡發(fā)生對(duì)魚(yú)肉細(xì)胞間隙有顯著影響，且細(xì)胞間隙的增加現(xiàn)象可持續(xù)整個(gè)冷藏期間（0～120 h）。本實(shí)驗(yàn)冷藏終點(diǎn)（72 h），Cys組細(xì)胞間隙為Con組的67.4%，表明經(jīng)HmCystatin C處理后能明顯延緩這一變化，這與2.2節(jié)Cys組剪切力與硬度的變化一致。

4 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片組織蛋白酶B/L活性的影響

由圖4可知，冷藏72 h內(nèi)盡管觀察到Con組的Cathepsin B/L活性整體上均明顯高于Cys組（

P

＜0.05），但兩組各自的Cathepsin L活性均未發(fā)生特別顯著的升高，冷藏24～72 h內(nèi)兩組魚(yú)肉Cathepsin B活性相較于初始值有所上升，且48 h及72 h的Con組顯著高于Cys組。團(tuán)隊(duì)在對(duì)Cathepsin B/L活性進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)（0～5 d）時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cathepsin B/L活性在冷藏4～5 d時(shí)才發(fā)生更加急劇的上升，明顯高于3 d時(shí)的活性水平（數(shù)據(jù)省略），與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致。Cathepsin B/L通常被認(rèn)為是動(dòng)物死后水解細(xì)胞骨架蛋白的主要蛋白酶，而本研究表明3 d冷藏期內(nèi)，Cathepsin B/L活性升高明并不明顯，因此判斷由其導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)蛋白水解有限。然而前述實(shí)驗(yàn)組冷藏魚(yú)肉片無(wú)論從宏觀質(zhì)構(gòu)品質(zhì)還是從組織學(xué)特性的肌細(xì)胞間隙微觀表征，均觀察到較為明顯的變化，因此推測(cè)，HmCystatin C對(duì)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)劣化的延緩作用，除了對(duì)Cathepsin B/L的抑制外，很可能還存在其他潛在機(jī)制。

5 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片中ROS相對(duì)含量的影響

ROS是凋亡發(fā)生的重要信號(hào)分子，線粒體是細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的主要場(chǎng)所，ROS的不斷積累可誘導(dǎo)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。由圖5可知，在0～72 h冷藏期間，兩組魚(yú)肉的ROS相對(duì)含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明魚(yú)宰后缺血缺氧的應(yīng)激條件下導(dǎo)致了ROS的產(chǎn)生。值得注意的是，Con組在24～72 h內(nèi)，以及Cys組24～72 h內(nèi)，都發(fā)生了ROS先有所下降而后升高的現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與消除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，ROS水平的下降，可能是由于此時(shí)細(xì)胞內(nèi)部的抗氧化酶清除了早期產(chǎn)生的ROS，此后由于內(nèi)環(huán)境被破壞使得ROS無(wú)法及時(shí)被清除而快速上升。在白斑狗魚(yú)以及鏡鯉宰后ROS水平測(cè)定中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的波動(dòng)現(xiàn)象。盡管可能由于注射刺激的原因，導(dǎo)致Cys組12 h時(shí)ROS積累，高于Con組，但是整體上Cys組ROS水平低于Con組，特別是24、72 h表現(xiàn)出顯著性（

P

＜0.05）。結(jié)果表明HmCystatin C處理抑制了肌肉細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化水平。研究表明Cystatin能抑制人牙齦成纖維細(xì)胞在病理?yè)p傷下發(fā)生的ROS升高。值得注意的是，ROS產(chǎn)生與凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，ROS的積累可造成線粒體功能障礙，導(dǎo)致線粒體膜受損，從而啟動(dòng)線粒體介導(dǎo)的凋亡過(guò)程。

6 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片肌細(xì)胞凋亡率的影響

經(jīng)典的TUNEL染色法可檢測(cè)到冷藏過(guò)程中凋亡晚期的草魚(yú)肌細(xì)胞，凋亡結(jié)果見(jiàn)圖6及表3。草魚(yú)宰后檢測(cè)到的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核（圖6中黃色圈所示呈棕色或棕褐色）隨著冷藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多。Li Hui等同樣用TUNEL染色證實(shí)了白斑狗魚(yú)宰后冷藏120 h過(guò)程中，有細(xì)胞凋亡的發(fā)生，凋亡肌細(xì)胞核的數(shù)量顯著增加。本實(shí)驗(yàn)中Cys組魚(yú)肉細(xì)胞凋亡率顯著（P＜0.05）低于Con組。到72 h時(shí)Con組凋亡率已達(dá)82.23%，而Cys組僅為48.3%。說(shuō)明HmCystatin C處理能明顯延緩冷藏草魚(yú)肉片肌細(xì)胞的凋亡速率。此外相對(duì)于細(xì)胞凋亡率初始值，Con組在24 h以及Cys組在48 h后均呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，結(jié)合細(xì)胞間隙隨凋亡的發(fā)生逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明伴隨凋亡率的增高肌纖維組織學(xué)特性亦會(huì)發(fā)生積累性的劣化，這也解釋了Con組剪切力和硬度都在24 h開(kāi)始發(fā)生下降，并在48～72 h更為明顯，而Cys組剪切力和硬度的下降得到延緩，在48 h才開(kāi)始發(fā)生明顯下降。目前在醫(yī)學(xué)方面的研究表明一定濃度范圍內(nèi)的Cystatin C可抑制缺血再灌注導(dǎo)致氧化應(yīng)激而引發(fā)的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡。此外，有研究表明，隨著細(xì)胞凋亡的激活，凋亡的細(xì)胞膜極性反轉(zhuǎn)會(huì)導(dǎo)致凋亡細(xì)胞與其他細(xì)胞分離，從而導(dǎo)致胞外空間增加，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)完整性被破壞，使得細(xì)胞間隙增大；對(duì)畜禽肉的研究發(fā)現(xiàn)，冷藏過(guò)程中影響肉嫩度形成的組織學(xué)特性指標(biāo)與細(xì)胞凋亡顯著相關(guān)。

7 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片中線粒體損傷及形態(tài)的影響

線粒體在調(diào)控細(xì)胞死亡中具有重要作用，線粒體損傷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體MPTP開(kāi)放性與膜電位常用于判斷宰后肌肉細(xì)胞中線粒體受損情況。此外，線粒體MPTP開(kāi)放在整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，隨著開(kāi)放程度的不斷增加，會(huì)促使多種凋亡因子釋放，進(jìn)而激活下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)。如圖7a所示，冷藏期間兩組線粒體在540 nm處的吸光度不斷降低，即MPTP開(kāi)放性不斷增加，線粒體受損越發(fā)明顯。線粒體膜電位的變化是細(xì)胞凋亡典型的早期標(biāo)志。隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，線粒體紅綠熒光比值（聚合物/單體）不斷降低（圖7b），即線粒體膜電位由正常的高水平向受損狀態(tài)的低水平轉(zhuǎn)變，同樣指示了線粒體的損傷程度在不斷增強(qiáng)。兩組的540 nm吸光度與線粒體膜電位在72 h時(shí)，相對(duì)初始值已發(fā)生明顯降低，尤其在48 h時(shí)下降迅速，這也與此階段的細(xì)胞凋亡率明顯增加的結(jié)果表現(xiàn)出一致性。但是冷藏期內(nèi)除初始點(diǎn)（差異不顯著）外，Cys組的A540 nm（圖7a）以及紅綠熒光比值（圖7b）均始終顯著高于Con組（

P

＜0.05），尤其在24 h內(nèi)的Con組A 540 nm的下降即MPTP開(kāi)放性呈現(xiàn)急劇變化趨勢(shì)，而Cys組的急劇下降則延遲至48 h開(kāi)始，說(shuō)明HmCystatin C抑制了冷藏草魚(yú)肌肉細(xì)胞線粒體的損傷，在前24 h內(nèi)的抑制效果尤為顯著，且該抑制效果一直持續(xù)到72 h。上述MPTP及膜電位在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)24 h及48 h的變化也一定程度上反映了Con組及Cys組硬度及剪切力在24 h及48 h的變化趨勢(shì)。

Fan Xiaowei等的研究表明，宰后魚(yú)肉在0～12 h內(nèi)，ATP的逐漸耗盡、pH值環(huán)境的改變及ROS的積累可導(dǎo)致線粒體功能障礙，這與本實(shí)驗(yàn)中12 h時(shí)Con組MPTP已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生急劇變化結(jié)果類(lèi)似。此外，結(jié)合前述HmCystatin C處理減少了宰后草魚(yú)魚(yú)肉細(xì)胞中ROS相對(duì)含量，說(shuō)明HmCystatin C對(duì)MPTP和膜電位表征的線粒體損傷的抑制效果與其抑制了冷藏期間ROS的積累存在潛在關(guān)聯(lián)，即可能由于Cys組線粒體受到的氧化刺激更小，線粒體受損程度更低。Hematyar等認(rèn)為線粒體功能障礙與蛋白降解高度相關(guān)，可將其作為魚(yú)肉鮮度評(píng)價(jià)的早期指標(biāo)。而本研究中HmCystatin C對(duì)線粒體損傷的抑制與其延緩了冷藏72 h內(nèi)草魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的劣化的確呈現(xiàn)了明顯的相關(guān)性。

8 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片肌細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

線粒體形態(tài)變化更直觀地反映了線粒體的損傷情況，如圖8所示，冷藏0 h時(shí)，兩組線粒體膜清晰，嵴的結(jié)構(gòu)良好，線粒體無(wú)腫脹，膜間隙無(wú)擴(kuò)張。隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，兩組發(fā)生不同程度的線粒體膜腫脹，嵴組織擴(kuò)張，呈空泡狀；但Cys組直至72 h才發(fā)生線粒體嵴部分消失，基質(zhì)致密化，而Con組損傷明顯更為嚴(yán)重，在24 h時(shí)線粒體嵴排列雜亂無(wú)章，線粒體嵴逐漸消失，72 h僅殘留少量腫脹線粒體嵴，線粒體基質(zhì)消失?？梢?jiàn)HmCystatin C處理后能明顯減輕線粒體損傷，這與其抑制MPTP開(kāi)放及膜電位降低的結(jié)果完全符合。目前在宰后冷藏的畜禽肉及魚(yú)肉中，都發(fā)現(xiàn)了隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)線粒體結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生破壞，畜禽肉冷藏3 d可觀察到線粒體明顯破壞，魚(yú)肉冷藏6 h便已觀察到線粒體損傷，到72 h時(shí)線粒體已明顯破壞。Li Xue等發(fā)現(xiàn)經(jīng)

N

-乙酰半胱氨酸處理冷藏的白斑狗魚(yú)肉肌肉細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)相比未處理組更為完整，但是

N

-乙酰半胱氨酸作為藥物無(wú)法在水產(chǎn)品中應(yīng)用。

9 HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片Caspase-3、Caspase-9活性及蛋白表達(dá)的影響

Caspase-9是線粒體途徑中典型的凋亡起始酶，可被線粒體內(nèi)釋放的細(xì)胞色素c激活，進(jìn)而活化下游的凋亡效應(yīng)酶Caspase-3執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序。Caspases介導(dǎo)的凋亡被認(rèn)為一直持續(xù)整個(gè)僵直期和解僵自溶成熟的早期。而魚(yú)死后的生化反應(yīng)速度及僵硬、解僵和自溶進(jìn)程都更快，因此控制Caspases活性及其介導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，對(duì)于魚(yú)肉片品質(zhì)的保持具有重要意義。Cystatins作為半胱氨酸蛋白酶的特異性抑制因子，在團(tuán)隊(duì)前期的體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)活性中心依賴(lài)半胱氨酸殘基的Caspases能夠表現(xiàn)抑制活性。本實(shí)驗(yàn)中，HmCystatin C處理前后的兩組Caspase-3及Caspase-9活性變化分別如圖9a、b所示。在冷藏期內(nèi)Cys組兩種酶的活性整體呈下降趨勢(shì)，前12 h與Con組差異不大，但24 h時(shí)HmCystatin C處理后的Cys組Caspase-3、Caspase-9活性明顯下降，加之未經(jīng)處理的Con組兩種酶活性急劇上升，因此此時(shí)Cys組都顯著低于Con組（

P

＜0.05）；此后，盡管Con組24 h后的各點(diǎn)活性逐步回落至基本與初始點(diǎn)持平，但Cys組Caspase-3、Caspase-9活性在72 h時(shí)均又發(fā)生明顯的降低，尤其是Caspase-3的活性，導(dǎo)致72 h時(shí)Cys組兩種酶活性仍顯著（

P

＜0.05）低于Con組。

本實(shí)驗(yàn)亦從蛋白水平上檢測(cè)了Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)情況（圖9c、d），有關(guān)畜禽及魚(yú)類(lèi)Caspase-3的研究已經(jīng)表明，該酶可由35 kDa左右的前體轉(zhuǎn)化為23 kDa和17 kDa的兩個(gè)活性片段。本實(shí)驗(yàn)中得到類(lèi)似結(jié)果，草魚(yú)Caspase-3活化體如圖9c中紅色箭頭所示。與酶活性檢測(cè)結(jié)果一致，Cys組兩種酶蛋白（前體及活性體）的表達(dá)量都在整體上呈現(xiàn)為低于Con組。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究表明，適宜濃度的Cystatin C對(duì)腦缺血再灌注導(dǎo)致的Caspase-2、Caspase-9蛋白表達(dá)升高有明顯的抑制作用。

此外，由于實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的主要為Caspase-3、Caspase-9的前體形式，因此各組內(nèi)的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與酶活性略有不同；特別是Con組Caspase-3和Caspase-9的前體均在前12 h表達(dá)量最高，而后逐漸下降，與其酶活性在24 h時(shí)最高有所差異，這可能是由于前體向活性體轉(zhuǎn)化以及酶活性的積累，尚需一定過(guò)程。

綜上，HmCystatin C處理整體上抑制了冷藏期間線粒體途徑凋亡相關(guān)的凋亡起始酶Caspase-9及凋亡效應(yīng)酶Caspase-3的活性和蛋白表達(dá)水平，該抑制作用在前12～24 h內(nèi)尤為明顯，且酶活性在冷藏結(jié)束72 h時(shí)，仍處于被有效抑制的狀態(tài)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中冷藏期間兩組細(xì)胞凋亡率及線粒體功能、形態(tài)變化趨勢(shì)和差異，推測(cè)HmCystatin C處理能夠延緩Caspase-3、Caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，且在12～24 h內(nèi)開(kāi)始發(fā)揮顯著作用，并能夠在72 h內(nèi)持續(xù)維持。動(dòng)物肉宰后品質(zhì)形成不僅與細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)變化有關(guān)，更為重要的是細(xì)胞凋亡的核心酶系Caspases還能參與骨架蛋白的水解，在宰后肉的成熟中發(fā)揮重要作用。凋亡相關(guān)核心酶Caspase-3、Caspase-9激活后能夠?qū)﹃笈＜≡w維蛋白進(jìn)行降解，參與了宰后肉質(zhì)構(gòu)的形成，而Caspase-3活性則與剪切力變化顯著相關(guān)。因此，這也合理解釋了本實(shí)驗(yàn)中冷藏72 h內(nèi)，Caspase-3和Caspase-9活性及表達(dá)被顯著抑制的Cys組，其草魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)（剪切力和硬度等）一直優(yōu)于Con組，特別是在24 h出現(xiàn)與Con組差異顯著的原因。

10 草魚(yú)肉片品質(zhì)指標(biāo)與線粒體途徑肌肉細(xì)胞凋亡各指標(biāo)的相關(guān)性分析

對(duì)冷藏草魚(yú)肉片各質(zhì)構(gòu)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)（剪切力、硬度、細(xì)胞間隙）與線粒體途徑細(xì)胞凋亡相關(guān)各指標(biāo)（ROS、線粒體通透性與膜電位、Caspase-3活性、Caspase-9活性、凋亡率）進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖10所示。由于Caspase-3、Caspase-9的作用具有積累性，因此采用積累性酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析。剪切力、硬度、細(xì)胞間隙質(zhì)構(gòu)指標(biāo)與ROS、MPTP、膜電位、Caspase-3及Caspase-9的積累酶活性、細(xì)胞凋亡率均呈相關(guān)性，其中剪切力與上述ROS、MPTP除外的4 個(gè)凋亡相關(guān)指標(biāo)呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。硬度與膜電位和凋亡率呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），與Caspase-3及Caspase-9積累酶活性呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。類(lèi)似的鐵槐茂也發(fā)現(xiàn)冷藏5 d內(nèi)的草魚(yú)剪切力與凋亡率呈極顯著負(fù)相關(guān)；冷藏牦牛肉背長(zhǎng)肌剪切力與Caspase-3活性變化顯著相關(guān)。細(xì)胞間隙與線粒體途徑細(xì)胞凋亡各指標(biāo)相關(guān)，但不顯著（ROS除外）。由此可知，線粒體途徑細(xì)胞凋亡顯著或極顯著地影響了冷藏草魚(yú)肉片的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)，對(duì)細(xì)胞間隙的增加起到一定作用。

魚(yú)肉片組織中ROS水平與剪切力呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)，與硬度及細(xì)胞間隙呈顯著相關(guān)（

P

＜0.05），提示組織ROS水平能夠在較大程度上反映魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的變化；同時(shí)ROS水平又與MPTP、膜電位呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)，與Caspase-3及Caspase-9積累酶活性及細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)（

P

＜0.05），提示通過(guò)ROS誘導(dǎo)的線粒體途徑的凋亡與質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的變化密切相關(guān)。

基于上述相關(guān)性分析以及HmCystatin C處理后對(duì)線粒體途徑凋亡的顯著抑制，說(shuō)明HmCystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化的延緩作用與其抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡關(guān)系極其密切，因此，這也是其改善冷藏魚(yú)片品質(zhì)的作用機(jī)制之一。

結(jié) 論

HmCystatin C注射處理草魚(yú)魚(yú)肉片可有效滲透到草魚(yú)肌肉組織內(nèi)部，顯著延緩了質(zhì)構(gòu)劣變，降低了魚(yú)肉組織內(nèi)ROS的水平；同時(shí)明顯抑制了肌肉細(xì)胞的凋亡率以及可能由此產(chǎn)生的肌細(xì)胞間隙的增加。冷藏72 h內(nèi)組織蛋白酶B/L活性增加并不明顯，尤其具有強(qiáng)力內(nèi)肽酶活性的組織蛋白酶L，因此HmCystatin C對(duì)草魚(yú)魚(yú)肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化的延緩作用，存在除抑制組織蛋白酶B/L活性之外的其他潛在機(jī)制。草魚(yú)肉片冷藏期間質(zhì)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)與魚(yú)肌肉細(xì)胞凋亡指標(biāo)、線粒體損傷程度呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，加之HmCystatin C處理能夠顯著抑制草魚(yú)肌肉細(xì)胞線粒體功能損傷和形態(tài)破壞，以及抑制線粒體途徑凋亡相關(guān)起始酶Caspase-9、執(zhí)行酶Caspase-3活性和蛋白表達(dá)水平；因此綜上判斷，HmCystatin C通過(guò)抑制調(diào)控魚(yú)宰后肌肉線粒體途徑的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，是其改善草魚(yú)魚(yú)肉片在冷藏72 h內(nèi)的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化的重要潛在機(jī)制。

在探索通過(guò)外源調(diào)控細(xì)胞凋亡延緩魚(yú)肉軟化方面，相對(duì)于目前多數(shù)研究采用的無(wú)法在食品加工中使用的Caspases廣譜或Caspase-3特異性化學(xué)抑制劑如Z-VADFMK、AC-DEVD-CHO，小分子HmCystatin C為魚(yú)源的天然活性抑制因子，安全性高，且在加工廢棄物中廣泛分布，易于制?。籋mCystatin C處理將質(zhì)構(gòu)品質(zhì)劣化延緩至少24 h，這對(duì)規(guī)模化的冷藏魚(yú)片水產(chǎn)品加工企業(yè)或銷(xiāo)售終端而言，都將十分有利，同時(shí)鑒于其還具有抑制魚(yú)肉內(nèi)源蛋白酶、抑制水產(chǎn)品腐敗微生物的多重活性，因此魚(yú)源HmCystatin C極具作為水產(chǎn)品生物保鮮劑的良好開(kāi)發(fā)前景。

本文《鰱魚(yú)Cystatin C對(duì)冷藏草魚(yú)肉片質(zhì)構(gòu)及線粒體途徑細(xì)胞凋亡的影響》來(lái)源于《食品科學(xué)》2025年46卷第15期145-154頁(yè)，作者：李龍飛，李樹(shù)紅*，錢(qián)鄧帆，蔣宇維，仝浩楠，李曉菲，白水萌，張穎，李冉。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250306-041。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：劉芯；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)