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Abstract

稻谷在高溫高濕條件下儲(chǔ)存時(shí)，因活性氧（ROS）代謝失衡而易發(fā)生品質(zhì)劣變。本研究采用介質(zhì)阻擋放電冷等離子體（DBD-CP）優(yōu)化程序處理稻谷，隨后于35 °C條件下儲(chǔ)存60天，以評(píng)估該處理對(duì)ROS代謝的調(diào)控作用及對(duì)各項(xiàng)儲(chǔ)存品質(zhì)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，DBD-CP處理顯著降低了稻谷的呼吸強(qiáng)度，儲(chǔ)存期間最大降幅達(dá)84.21%（P?<?0.05）。丙二醛（MDA）含量從第20天起顯著下降（P?<?0.05）。ROS定量顯示，第30天時(shí)總ROS減少18.15%，而特定ROS組分O???、H?O?和HO·的含量分別在第40天、第60天和第50天下降了41.86%、43.72%和57.48%，從而緩解了氧化應(yīng)激?？寡趸憫?yīng)得到增強(qiáng)，總酚（TPC）和總黃酮（TFC）含量以及總體抗氧化能力均顯著增加（P?<?0.05）。酶活性分析表明，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性提高了29.11%，而過(guò)氧化物酶（POD）活性降低了47.37%，這減少了對(duì)酚類物質(zhì)的氧化消耗，限制了ROS的過(guò)度積累。利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）對(duì)儲(chǔ)存期間ROS的時(shí)空分布進(jìn)行了可視化及統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，DBD-CP處理有效抑制了稻谷儲(chǔ)存過(guò)程中ROS的爆發(fā)，顯著降低了其熒光信號(hào)強(qiáng)度，并維持了其穩(wěn)定性。綜上所述，DBD-CP處理能有效調(diào)控酶促與非酶促抗氧化機(jī)制，顯著降低ROS水平，從而改善稻谷的儲(chǔ)存品質(zhì)。

Introduction

作為全球最重要的主食之一，稻谷在人類營(yíng)養(yǎng)和全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。它富含淀粉、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，是能量和營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源。稻谷的濕基含水量約為14%，遠(yuǎn)低于新鮮果蔬通常超過(guò)80%的含水量，因此更適合經(jīng)濟(jì)高效的采后儲(chǔ)存。一旦穩(wěn)定，稻谷即進(jìn)入代謝活性低的休眠狀態(tài)，有利于安全儲(chǔ)藏。中國(guó)稻谷年產(chǎn)量超過(guò)2億噸，占全球總產(chǎn)量的30%以上。然而，不當(dāng)?shù)膬?chǔ)存，尤其是在高溫條件下，每年導(dǎo)致高達(dá)2500萬(wàn)噸的損失。因此，提高儲(chǔ)存安全性對(duì)于減少損失、維持品質(zhì)和保障糧食供應(yīng)至關(guān)重要，特別是在面對(duì)自然災(zāi)害和人為干擾時(shí)。

稻谷的采后儲(chǔ)存不僅能保持籽粒完整性，還能延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間并減少品質(zhì)劣變。收獲后，稻谷籽粒的生理活性及營(yíng)養(yǎng)成分在內(nèi)源調(diào)控機(jī)制和外部環(huán)境因素（尤其是高溫高濕等不利條件）的共同作用下發(fā)生變化。這一劣變過(guò)程涉及多種物理、化學(xué)和生物轉(zhuǎn)化，直接影響稻谷的品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性。儲(chǔ)存相關(guān)的劣變包括黃變、脂質(zhì)氧化、淀粉回生、蛋白質(zhì)變性、風(fēng)味劣變、適口性下降、真菌滋生以及蟲害侵染。這些過(guò)程通常相互關(guān)聯(lián)，在時(shí)間序列上重疊發(fā)生?；钚匝酰≧OS）作為種子內(nèi)部的關(guān)鍵信號(hào)分子和品質(zhì)指標(biāo)，與稻谷籽粒的各種生理生化反應(yīng)密切相關(guān)，并且是品質(zhì)劣變的最早期標(biāo)志物之一。

ROS包含一大類含氧自由基和過(guò)氧化物，它們是好氧代謝過(guò)程中易產(chǎn)生的副產(chǎn)物。與定義為具有未成對(duì)電子的分子的自由基不同，ROS含有一個(gè)或多個(gè)活性氧原子，例如過(guò)氧化氫（H?O?）。自由基因其未成對(duì)電子而具有極高的化學(xué)反應(yīng)活性。雖然H?O?不是自由基，但由于其氧化電位，它仍然具有高反應(yīng)活性。這些活性含氧物種參與生物系統(tǒng)內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，氧化細(xì)胞組分和生物分子。代表性的ROS包括羥基自由基（HO·）、超氧陰離子自由基（O???）、過(guò)氧自由基（HOO·）、單線態(tài)氧（1O?）以及各種過(guò)氧化物如H?O?。這些比大氣中O?反應(yīng)性更強(qiáng)的分子或離子，來(lái)源于O?，并以部分還原的形態(tài)存在于生物體內(nèi)。O?可以被激發(fā)形成1O?，或者通過(guò)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，接受1個(gè)電子形成O???，接受2個(gè)電子形成H?O?，接受3個(gè)電子形成HO·。這些ROS在許多生化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝以及抗菌和抗病毒活性等。然而，它們也可能對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等生物分子造成氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡和各種疾病。因此，細(xì)胞必須通過(guò)抗氧化系統(tǒng)維持ROS的平衡，以防御氧化損傷。

介質(zhì)阻擋放電冷等離子體（DBD-CP）技術(shù)利用周圍介質(zhì)產(chǎn)生光電子、離子和自由基等活性物種。這些活性物種在非熱環(huán)境下影響樣品內(nèi)部代謝途徑，同時(shí)保留其營(yíng)養(yǎng)成分。目前，DBD-CP技術(shù)已被證明在食品儲(chǔ)藏與保鮮中發(fā)揮著積極作用。DBD-CP在食品儲(chǔ)存中的廣泛應(yīng)用很大程度上歸因于其對(duì)ROS代謝的影響。DBD-CP電離氣體產(chǎn)生的活性物種在非熱條件下被引入樣品，與ROS代謝相互作用，進(jìn)而調(diào)控樣品內(nèi)部的抗氧化防御系統(tǒng)。研究表明，適當(dāng)?shù)腄BD-CP處理可減少細(xì)胞內(nèi)ROS積累，從而抑制與氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝失衡。探究DBD-CP與ROS代謝的關(guān)系，不僅能凸顯其在非熱保鮮方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，也為食品品質(zhì)調(diào)控提供了新的思路和技術(shù)支持。本研究探討了DBD-CP處理對(duì)稻谷儲(chǔ)存期間ROS代謝的影響，分析了與ROS代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)的關(guān)鍵代謝酶的變化，并從儲(chǔ)藏學(xué)的角度闡明了稻谷儲(chǔ)藏品質(zhì)劣變的內(nèi)源生物學(xué)機(jī)制。本研究旨在為稻谷的綠色儲(chǔ)藏提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

圖1 DBD-CP反應(yīng)器示意圖

Results and Discussion

DBD-CP對(duì)儲(chǔ)存稻谷呼吸強(qiáng)度及MDA含量的影響

稻谷籽粒在儲(chǔ)存期間仍保持代謝活性，通過(guò)呼吸作用維持生命過(guò)程。然而，在高水分稻谷中，過(guò)度的呼吸作用可能導(dǎo)致糧堆發(fā)熱，從而加速品質(zhì)劣變。如圖2A所示，對(duì)照組和DBD-CP處理樣品的呼吸強(qiáng)度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在第10天達(dá)到峰值。值得注意的是，處理組的呼吸速率相較于對(duì)照組顯著降低了47.15%（P?<?0.01）。這一下降趨勢(shì)在整個(gè)儲(chǔ)存期間持續(xù)，并在第40天觀察到最大降幅，達(dá)84.21%。這些結(jié)果表明，DBD-CP處理有效抑制了過(guò)度的呼吸作用，維持了較低的代謝活性，并延緩了儲(chǔ)存期間的品質(zhì)劣變。此效應(yīng)可能是通過(guò)直接和ROS介導(dǎo)的調(diào)控途徑，調(diào)節(jié)ROS代謝及抗氧化酶活性，從而緩解氧化應(yīng)激、穩(wěn)定線粒體功能并降低能量需求來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 DBD-CP調(diào)控儲(chǔ)存稻谷的呼吸強(qiáng)度（A），降低其脂質(zhì)過(guò)氧化水平（MDA含量）（B）

MDA是膜脂質(zhì)過(guò)氧化的關(guān)鍵標(biāo)志物，反映了稻谷籽粒的氧化損傷程度。如圖2B所示，從第20天起，DBD-CP處理組的MDA含量顯著低于對(duì)照組（P?<?0.05），這表明DBD-CP處理增強(qiáng)了抗氧化酶活性，促進(jìn)了自由基的及時(shí)清除。這進(jìn)而減輕了對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷，并延緩了儲(chǔ)存期間的品質(zhì)劣變。在所有樣品中，MDA水平均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與先前報(bào)道一致。這一趨勢(shì)可能歸因于儲(chǔ)存后期游離脂肪酸（FFA）酶促氧化的減弱。先前研究表明，在35 °C下儲(chǔ)存0～60天期間，DBD-CP處理組和對(duì)照組的初始FFA水平相當(dāng)，介于19.98～21.82 mg KOH/100 g之間。然而，60 d后，對(duì)照組的FFA顯著增加至27.19 mg KOH/100 g，而處理組僅增加至25.19 mg KOH/100 g，增幅較小。由于FFA是脂質(zhì)氧化的直接底物，處理組中FFA積累較少表明DBD-CP處理減輕了酶促脂質(zhì)氧化，從而減少了脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，并進(jìn)而抑制了MDA的積累。這一機(jī)制有效地保持了膜完整性，降低了氧化損傷，最終促進(jìn)了稻谷在儲(chǔ)存期間的品質(zhì)穩(wěn)定性。

DBD-CP調(diào)控儲(chǔ)存稻谷中的ROS

ROS是含有一個(gè)或多個(gè)源自分子氧的活性氧原子的化學(xué)反應(yīng)性分子。這些物種參與生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，能夠氧化細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物分子。ROS的主要類型包括HO·、O???、HOO·、1O?以及過(guò)氧化物如H?O?。在環(huán)境脅迫下，植物細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生顯著增加。當(dāng)ROS積累超過(guò)細(xì)胞的耐受閾值時(shí)，抗氧化酶活性受損，導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)崩潰。如圖3A所示，對(duì)照組中的ROS水平在儲(chǔ)存期間先上升后下降，并在第30天達(dá)到峰值354.36 ng/g。相比之下，DBD-CP處理組的ROS水平保持相對(duì)穩(wěn)定，且從第30天起顯著低于對(duì)照組（P?<?0.01），最高濃度僅為297.41 ng/g。這些結(jié)果表明，DBD-CP處理在整個(gè)儲(chǔ)存期間有效調(diào)控了ROS的積累，從而提高了稻谷籽粒長(zhǎng)期保鮮的潛力。

圖3 DBD-CP處理下儲(chǔ)存稻谷中ROS的動(dòng)態(tài)變化與相互轉(zhuǎn)化

在種子儲(chǔ)存期間，經(jīng)由電子傳遞鏈的呼吸電子傳遞最終將氧氣還原為水，該過(guò)程同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生O???作為副產(chǎn)物。儲(chǔ)存60天后，對(duì)照組中的O???含量從0.0127增至0.0226 μmol/g，幾乎翻倍（圖3B）。相比之下，DBD-CP處理組僅從0.0129小幅增至0.0153 μmol/g，增幅僅為18.31%。隨著儲(chǔ)存的進(jìn)行，O???被超氧化物歧化酶（SOD）催化轉(zhuǎn)化為H?O?。對(duì)照組中H?O?水平持續(xù)上升，至第60天達(dá)到峰值97.07 μmol/g。相反，DBD-CP處理組的H?O?含量逐漸下降，第60天時(shí)的水平約為對(duì)照組的一半（圖3C），且從第20天起差異達(dá)到高度顯著（P?<?0.01）。隨后，H?O?通過(guò)涉及Fe2?或Cu2?等過(guò)渡金屬離子的芬頓型反應(yīng)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為HO·。HO·自由基以其極高的反應(yīng)活性和細(xì)胞毒性著稱，在對(duì)照組中儲(chǔ)存60 d后積累至1548.61 L/(mol·cm·kg)（圖3D）。相比之下，DBD-CP處理組的HO·積累量顯著更低，為701.39 L/(mol·cm·kg)（P?<?0.01）。這些結(jié)果表明，DBD-CP處理有效抑制了儲(chǔ)存期間O???、H?O?和HO·的積累，從而減輕了氧化損傷。

觀察到的變化可能歸因于DBD-CP處理對(duì)稻谷籽粒生理代謝過(guò)程的多方面調(diào)控作用。一種可能的機(jī)制是，DBD-CP誘導(dǎo)了儲(chǔ)存期間呼吸速率的降低，這可能限制了線粒體電子傳遞鏈中的電子泄漏。在該鏈中，分子氧在接受電子后被還原為O???，這一過(guò)程通常由呼吸作用末端的醌、半醌和非血紅素鐵蛋白等電子載體啟動(dòng)。通過(guò)抑制呼吸速率，DBD-CP可能抑制了O???的過(guò)量產(chǎn)生。由于O???是H?O?合成的前體，其生成的減少將導(dǎo)致H?O?積累的降低。此外，DBD-CP處理可能激活了抗氧化防御系統(tǒng)，增強(qiáng)了過(guò)氧化氫酶（CAT）等ROS清除酶的活性，從而促進(jìn)了H?O?的分解，限制了其作為底物通過(guò)芬頓型反應(yīng)形成HO·。因此，觀察到的HO·含量降低很可能與細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的改善有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，DBD-CP處理通過(guò)調(diào)控ROS的產(chǎn)生和抗氧化反應(yīng)，有助于維持儲(chǔ)存稻谷籽粒中的ROS平衡。

O???、H?O?和HO·對(duì)DBD-CP處理的不同響應(yīng)，主要取決于它們?cè)赗OS代謝鏈中的位置、相關(guān)酶活性及其調(diào)控特性。O???位于ROS生成的源頭，主要作為呼吸過(guò)程中線粒體電子傳遞鏈電子泄漏的副產(chǎn)物而產(chǎn)生。雖然DBD-CP能從儲(chǔ)存初期就抑制呼吸速率、減少電子泄漏，但由于細(xì)胞內(nèi)存在多條O???產(chǎn)生途徑，且其與SOD之間存在動(dòng)態(tài)平衡，O???含量的整體下降顯現(xiàn)得相對(duì)較慢。H?O?在ROS代謝途徑中處于中間位置，由O???經(jīng)SOD催化轉(zhuǎn)化生成，并被CAT和POD等抗氧化酶分解。DBD-CP不僅減少了O???的供給，還可能激活了抗氧化酶活性，從而導(dǎo)致了H?O?水平在儲(chǔ)存中期持續(xù)下降。HO·位于ROS級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端階段，具有極高的反應(yīng)活性，主要由H?O?通過(guò)芬頓型反應(yīng)產(chǎn)生。由于DBD-CP在儲(chǔ)存早期就顯著降低了H?O?水平，從而有效阻斷了HO·生成的主要途徑，使得HO·成為第一個(gè)表現(xiàn)出顯著抑制的ROS。

DBD-CP調(diào)控儲(chǔ)存稻谷籽粒的抗氧化能力

總酚與總黃酮是植物中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在清除自由基、減輕氧化損傷方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們是緩解ROS的非酶促抗氧化系統(tǒng)的組成部分。如圖4A所示，從儲(chǔ)存第20天起，DBD-CP處理組的總酚含量（TPC）顯著高于對(duì)照組（P?<?0.05），并于第40天達(dá)到峰值94.82 mg GAE/100 g DW，而對(duì)照組的最高值為87.02 mg GAE/100 g DW。類似地，在圖4B中，處理組的總黃酮含量（TFC）在第40天達(dá)到峰值92.61 mg GAE/100 g DW，而對(duì)照組在第10天達(dá)到其最高水平83.70 mg GAE/100 g DW。這可以歸因于DBD-CP處理調(diào)控了與次級(jí)代謝相關(guān)的酶（如苯丙氨酸解氨酶（PAL））的活性，從而促進(jìn)了酚類物質(zhì)（包括阿魏酸、沒(méi)食子酸等）與黃酮類化合物的積累。該處理很可能刺激了稻谷籽粒的抗氧化系統(tǒng)或代謝響應(yīng)，從而使其在儲(chǔ)存期間保持持續(xù)高水平的抗氧化特性。

圖4 DBD-CP處理增強(qiáng)儲(chǔ)存稻谷的生物活性化合物含量及抗氧化能力

ABTS和DPPH測(cè)定法有效測(cè)量了稻谷樣品對(duì)自由基的清除能力。如圖4C-D所示，在儲(chǔ)存期間，DBD-CP處理組的ABTS自由基清除能力顯著提高（P?<?0.05），最大增幅達(dá)10%。對(duì)于DPPH自由基清除能力，DBD-CP處理有效減少了DPPH水平的波動(dòng)，使其清除率維持在90%。這可能是由于DBD-CP處理刺激了稻谷籽粒中TPC和TFC的合成，從而增強(qiáng)了其自由基清除能力。這些結(jié)果表明，DBD-CP技術(shù)有效增強(qiáng)了儲(chǔ)存稻谷籽粒的抗氧化特性，有助于延緩氧化反應(yīng)引起的品質(zhì)劣變。

DBD-CP激活儲(chǔ)存稻谷中的活性氧代謝酶系統(tǒng)

APX和CAT是不同類別的H?O?清除劑，能有效清除ROS。APX參與信號(hào)調(diào)節(jié)，而CAT主要清除過(guò)量的ROS。維持這些抗氧化酶活性之間的平衡對(duì)于穩(wěn)定ROS水平、有效避免有毒HO·的過(guò)量產(chǎn)生至關(guān)重要。如圖5A-B所示，對(duì)照組稻谷籽粒中的APX活性在儲(chǔ)存過(guò)程中下降，而DBD-CP處理組的APX活性則顯著增加（P?<?0.01）。在第40天，處理組的APX活性高出近30%，達(dá)到峰值109.65 U/g。盡管對(duì)照組的CAT活性在儲(chǔ)存期間有所波動(dòng)，但DBD-CP處理組的CAT活性顯著更高（P?<?0.05），到第20天時(shí)增加了50%。這些發(fā)現(xiàn)表明，DBD-CP處理通過(guò)提高ROS清除酶活性和增強(qiáng)抗氧化能力，從而降低ROS水平，有助于延緩稻谷的品質(zhì)劣變。

圖5 DBD-CP誘導(dǎo)儲(chǔ)存稻谷中關(guān)鍵ROS清除酶活性升高

SOD是一類金屬酶，能催化O???轉(zhuǎn)化為H?O?和O?。通過(guò)這種方式，SOD降低了O???的濃度，減輕了由O???直接引起的氧化損傷。如圖5C所示，稻谷籽粒中的SOD活性隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但DBD-CP處理抑制了這種下降，有助于盡可能維持SOD活性。DBD-CP處理組的SOD活性僅下降2%，而對(duì)照組則下降了12%。這表明DBD-CP處理通過(guò)維持SOD活性增強(qiáng)了ROS清除能力。POD是一種促進(jìn)酚類化合物氧化的酶。這種氧化會(huì)導(dǎo)致醌類物質(zhì)的形成，引起稻谷籽粒黃變和品質(zhì)下降。如圖5D所示，DBD-CP處理顯著影響了POD活性。對(duì)照組中，POD活性在儲(chǔ)存期間持續(xù)上升，在第60天達(dá)到最大值2.93 U/g。相比之下，DBD-CP處理組的POD活性較未處理組略有下降，穩(wěn)定在1.5 U/g，顯著低于對(duì)照組（P?<?0.01）。POD活性的降低可能減輕了對(duì)酚類底物的氧化消耗，這有助于DBD-CP處理稻谷中TPC的增加，從而延緩了品質(zhì)劣變。

基于激光共聚焦分析的儲(chǔ)存稻谷籽粒中ROS熒光成像及相關(guān)性分析

儲(chǔ)存稻谷籽粒中ROS的分布與動(dòng)態(tài)變化對(duì)于理解其生理作用至關(guān)重要。激光共聚焦顯微鏡作為一種高分辨率成像技術(shù)，能有效直接觀察稻谷籽粒中ROS的分布。通過(guò)使用DCFH熒光探針對(duì)米粉進(jìn)行染色，稻谷籽粒內(nèi)的ROS會(huì)與探針?lè)磻?yīng)，產(chǎn)生能發(fā)射特定熒光信號(hào)的產(chǎn)物。激光共聚焦顯微鏡可捕獲這些熒光信號(hào)，從而對(duì)稻谷籽粒組織中的ROS含量進(jìn)行可視化呈現(xiàn)（圖6）。該技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)稻谷籽粒ROS水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，還為研究稻谷種子活力、衰老及脅迫響應(yīng)機(jī)制提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。從圖6的熒光顯微鏡圖像中可明顯看出，對(duì)照組中ROS熒光信號(hào)強(qiáng)度在儲(chǔ)存期間有波動(dòng)，而處理組的信號(hào)強(qiáng)度則保持相對(duì)穩(wěn)定，波動(dòng)較小。處理組的ROS熒光信號(hào)強(qiáng)度低于對(duì)照組，這支持了先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這表明DBD-CP處理有助于減緩稻谷籽粒儲(chǔ)存過(guò)程中ROS的積累，將ROS水平維持在相對(duì)較低且穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖6 儲(chǔ)存稻谷中ROS積累的時(shí)空可視化分析

對(duì)獲得的ROS激光共聚焦圖像，使用MATLAB進(jìn)行處理和分析，通過(guò)研究熒光圖像的綠色分量，實(shí)現(xiàn)對(duì)稻谷中ROS信號(hào)的定量分析。具體提取綠色（G）與紅色（R）通道，并對(duì)紅色通道應(yīng)用閾值為200的二值化處理以創(chuàng)建掩膜，將像素值低于此閾值的區(qū)域標(biāo)記為目標(biāo)區(qū)域。隨后將此掩膜應(yīng)用于綠色通道，將非目標(biāo)區(qū)域的像素值設(shè)置為0，生成過(guò)濾后的綠色通道圖像。所得熒光圖像的G分量圖（圖6）通常代表了特定ROS熒光探針（即DCFH-DA標(biāo)記的ROS）的信號(hào)。隨后，將過(guò)濾后綠色通道圖像的灰度值劃分為8個(gè)區(qū)間，并統(tǒng)計(jì)各區(qū)間內(nèi)的總灰度值，以分析不同強(qiáng)度范圍內(nèi)的灰度分布特征，從而反映ROS水平的變化。為進(jìn)一步可視化分析結(jié)果，繪制了綠色分量熒光強(qiáng)度的直方圖，展示了稻谷籽粒中ROS的定量分布特征（例如，見(jiàn)圖6）。對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與ROS含量進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，兩者呈顯著正相關(guān)，對(duì)照組R2＝0.8990，處理組R2＝0.8492。這些結(jié)果表明，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行ROS熒光成像是可行的。這種直觀的定性方法可有效地用于研究和比較稻谷籽粒中的ROS信號(hào)。它不僅反映了不同處理?xiàng)l件下ROS水平的差異，也為后續(xù)的功能驗(yàn)證提供了數(shù)據(jù)支持。該方法結(jié)合了激光共聚焦顯微鏡的高分辨率成像能力與MATLAB的定量分析特性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ROS信號(hào)的精確檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)評(píng)估。此外，通過(guò)與其他生理生化指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，該方法還能揭示ROS在稻谷籽粒生理活動(dòng)中的作用機(jī)制，為稻谷籽粒的品質(zhì)評(píng)估與生物學(xué)研究提供了一種簡(jiǎn)便可靠的技術(shù)手段。

皮爾遜相關(guān)性分析揭示了稻谷種子中ROS及其主要組分、抗氧化酶活性與次級(jí)代謝產(chǎn)物之間的顯著關(guān)聯(lián)?？俁OS與其主要組分H?O?和O???之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.561和0.718（P?<?0.05），表明這些組分是ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源。ROS水平與SOD活性呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（R2＝?0.934，P?<?0.05），而POD活性則與ROS（R2＝0.775，P?<?0.05）及H?O?（R2＝0.755，P?<?0.05）均呈顯著正相關(guān)。此外，APX活性與TFC（R2＝0.842，P?<?0.05）及ABTS抗氧化能力（R2＝0.770，P?<?0.05）呈強(qiáng)正相關(guān)，同時(shí)TPC與TFC（R2＝0.788，P?<?0.05）以及TPC與DPPH/ABTS抗氧化能力之間也觀察到顯著相關(guān)性（P?<?0.05）。相反，呼吸強(qiáng)度與ABTS抗氧化能力呈顯著負(fù)相關(guān)（R2＝?0.602，P?<?0.05），這表明代謝活性與氧化還原狀態(tài)之間存在相互作用（圖7）。

圖7 相關(guān)性分析揭示DBD-CP處理儲(chǔ)存稻谷中ROS代謝參數(shù)間的內(nèi)在聯(lián)系

這些相關(guān)性表明，稻谷種子中的氧化應(yīng)激響應(yīng)存在一種協(xié)調(diào)的調(diào)控機(jī)制。SOD似乎通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)來(lái)緩解ROS水平，而POD活性的正相關(guān)性可能提示其通過(guò)促進(jìn)TPC積累來(lái)協(xié)助ROS清除、緩解氧化應(yīng)激的作用。APX與黃酮類化合物及ABTS抗氧化能力之間的強(qiáng)正相關(guān)，表明其兼具催化H?O?分解和激活次級(jí)代謝途徑以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的雙重功能。包括TPC和TFC在內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可能通過(guò)直接清除自由基或調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)增強(qiáng)DPPH/ABTS抗氧化能力。呼吸強(qiáng)度與ABTS抗氧化能力之間的負(fù)相關(guān)，提示能量代謝與抗氧化防御之間存在動(dòng)態(tài)平衡。呼吸作用增強(qiáng)可能導(dǎo)致氧化中間產(chǎn)物的積累，而抗氧化系統(tǒng)的激活則通過(guò)抑制過(guò)度呼吸來(lái)幫助維持氧化還原平衡。這一復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明，抗氧化酶、次級(jí)代謝產(chǎn)物與ROS通過(guò)相互關(guān)聯(lián)的反饋機(jī)制協(xié)同作用，建立起動(dòng)態(tài)平衡，構(gòu)成了抵御氧化損傷的關(guān)鍵防御系統(tǒng)（圖8）。

圖8 DBD-CP介導(dǎo)的儲(chǔ)存稻谷ROS穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制

Conclusion

本研究探討了DBD-CP處理對(duì)儲(chǔ)存稻谷籽?；钚匝醮x的影響。DBD-CP處理顯著降低了呼吸強(qiáng)度，使與代謝相關(guān)的品質(zhì)劣變減少了84.21%。它還減少了MDA的積累，從而通過(guò)增強(qiáng)抗氧化防御來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜。動(dòng)態(tài)ROS分析顯示，O???、H?O?和HO·水平降低，這與呼吸作用減弱和抗氧化酶活性升高相關(guān)。值得注意的是，儲(chǔ)存后期H?O?水平降低了近50%，而HO·水平降低超過(guò)兩倍，這突顯了DBD-CP在減輕氧化損傷方面的功效。

DBD-CP還增強(qiáng)了稻谷的抗氧化能力，增加了TPC和TFC，并提高了自由基清除活性（ABTS、DPPH）。它上調(diào)了APX、CAT和SOD的活性，加速了ROS清除，同時(shí)抑制了POD活性以保存酚類化合物并最大限度地減少氧化應(yīng)激。此外，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)熒光標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)ROS代謝過(guò)程的動(dòng)態(tài)可視化，并通過(guò)對(duì)所得圖像的G值變量進(jìn)行評(píng)估實(shí)現(xiàn)定量分析。結(jié)果表明，與對(duì)照組ROS熒光信號(hào)強(qiáng)度的劇烈波動(dòng)相比，經(jīng)DBD-CP處理的稻谷籽粒中ROS熒光強(qiáng)度顯著降低并保持穩(wěn)定。這證實(shí)了該處理能有效抑制儲(chǔ)存期間ROS的爆發(fā)，維持穩(wěn)定的ROS水平。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，DBD-CP處理通過(guò)調(diào)節(jié)酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)，有效調(diào)控了ROS代謝，減少了氧化損傷，并提高了儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

在本研究中，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)是在高溫高濕的環(huán)境脅迫條件下連續(xù)進(jìn)行60 d，模擬了對(duì)稻谷品質(zhì)構(gòu)成重大挑戰(zhàn)的極端儲(chǔ)存環(huán)境。在此嚴(yán)苛條件下，DBD-CP處理仍能有效維持ROS代謝平衡和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，顯示出顯著的保護(hù)效果。展望未來(lái)，若應(yīng)用于典型的低溫低濕儲(chǔ)存條件，DBD-CP技術(shù)有望在更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期內(nèi)發(fā)揮更持久的作用，從而進(jìn)一步延緩稻谷的品質(zhì)劣變。同時(shí)，該技術(shù)在工業(yè)化儲(chǔ)糧環(huán)境中擴(kuò)展性高，可與現(xiàn)有通風(fēng)、溫控系統(tǒng)集成，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化與智能化操作。此外，該處理過(guò)程具有能耗低、無(wú)需額外化學(xué)試劑、綠色安全環(huán)保的特點(diǎn)。未來(lái)的研究應(yīng)繼續(xù)評(píng)估其在常規(guī)儲(chǔ)存條件下的長(zhǎng)期性能及作用機(jī)理，為保障糧食質(zhì)量和食品安全提供更可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

Temporal spatial profiling of reactive oxygen species metabolic dynamics in cold plasma-treated paddy rice during postharvest storage

Qiang Liu1*, Yijia Zhang1, Haijing Wu2, Yong Wang3, Qianyu Hang4, Siqi Zhao1, Chao Ding1

1 Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing, 210023, China

2 Nanjing Institute for Food and Drug Control, Nanjing, 210038, China

3 Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing, 100037, China

4 Department of Biological and Agricultural Engineering, North Carolina State University, Raleigh, NC, 27695, USA

*Corresponding author.

Abstract

Paddy rice is prone to quality deterioration during storage due to imbalances in reactive oxygen species (ROS) metabolism under high-temperature and high-humidity conditions. In this work, the optimized procedure by dielectric barrier discharge cold plasma (DBD-CP) was applied to paddy rice grains, and stored at 35 °C for 60 days. The regulation of ROS metabolism and the significance of various storage quality indicators were evaluated. In the results, DBD-CP treatment significantly reduced respiration intensity, with a maximum decrease of 84.21% (P?<?0.05) during storage period. Malondialdehyde (MDA) content showed a significant decline from day 20 onward (P?<?0.05). ROS quantification revealed an 18.15% reduction at 30 days, while levels of specific ROS species O2??, H2O2, and HO· decreased by 41.86% (day 40), 43.72% (day 60), and 57.48% (day 50), respectively, alleviating oxidative stress. Antioxidant responses were enhanced, with total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC), as well as overall antioxidant capacity, significantly increased (P?<?0.05). Enzyme activity analysis indicated that ascorbate peroxidase (APX) activity increased by 29.11%, while peroxidase (POD) activity decreased by 47.37%, reducing oxidative depletion of phenolics, limiting excessive ROS accumulation. The temporal and spatial distribution of ROS during storage was visualized and statistically analyzed using a confocal laser scanning microscope (CLSM). The results showed that DBD-CP treatment effectively suppressed the burst of ROS during rice storage, significantly reduced its fluorescence signal intensity, and maintained its stability. Overall, DBD-CP treatment effectively modulated both enzymatic and non-enzymatic antioxidant mechanisms, significantly reducing ROS levels and improving the storage quality of paddy rice grains.

Reference:

Liu, Q., Zhang, Y., Wu, H. et al. Temporal spatial profiling of reactive oxygen species metabolic dynamics in cold plasma-treated paddy rice during postharvest storage. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 29 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00033-5

翻譯：陳師昀（實(shí)習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片來(lái)源：攝圖網(wǎng)

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