師兄，我的培養(yǎng)基脫氣少了一會，OCR 和 ECAR 的基線波動就很大

如果沒有充分脫氣，放入儀器后培養(yǎng)基里溶解的 CO? 會迅速逸出，導致 pH 持續(xù)上升，細胞代謝狀態(tài)會受到影響，數(shù)據(jù)也就不能反映真實情況了。

崩潰！就湊合了這一步，一整周白干了！

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（答案都在本文內哦，請耐心閱讀）

做細胞能量代謝檢測都要注意哪些細節(jié)呢？這就以最常用的【ATP 產生速率檢測】為例，為大家詳解實驗準備和操作方案：

實驗前一天

1. 打開 Seahorse 代謝分析儀，使溫度穩(wěn)定。

2.對于貼壁細胞，用適當?shù)募毎L培養(yǎng)基將細胞以預先確定的密度接種到 Seahorse XF 微孔板（懸浮細胞在實驗當天準備即可）。

3.在 37℃ 無 CO? 培養(yǎng)箱中過夜水化探針板。

4. 在 Wave 里設計實驗或使用 ATP 產生速率實驗模板（標準或誘導的實驗）。根據(jù)特定實驗設計，對模板進行必要的分組修改。

實驗當天

1. 無菌條件下，往 100 mL Seahorse XF DMEM 培養(yǎng)基，pH 7.4 中添加 10 mM XF 葡萄糖，1 mM XF 丙酮酸鈉，2 mM XF 谷氨酰胺。這些是推薦的起始條件；然而，所需的檢測液組分可根據(jù)細胞類型或體外培養(yǎng)條件而改變。

2. 溫熱檢測液到 37℃。

3. 37℃ 孵育直至準備使用。

注意：如果檢測液與此配方有顯著不同（即更高濃度的 XF 葡萄糖，XF 丙酮酸鈉或 XF 谷氨酰胺和 / 或其他培養(yǎng)基添加劑），如有必要，檢查檢測液的 pH 值并調至 7.4，需按照 Buffer Factor Protocol 測定緩沖系數(shù)值。

準備 Seahorse XF 細胞培養(yǎng)微孔板：

對于貼壁細胞：

1. 從 37℃ CO? 培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)微孔板，在顯微鏡下檢查細胞以確認種板的一致性和正常的細胞形態(tài)。

2．棄去細胞培養(yǎng)微孔板中的細胞生長培養(yǎng)基。使用多通道移液器用預熱的檢測液洗細胞一次，然后置于 37℃ 無 CO? 培養(yǎng)箱中用檢測液孵育 45～60 分鐘。

3. 在開始 XF 實驗前，再次棄去檢測液并在每孔加入新鮮，預熱的檢測液。

對于懸浮細胞：

1. 從生長培養(yǎng)基中沉淀細胞，并用預熱的檢測液重懸。

2. 計數(shù)細胞，以這樣一個濃度懸浮細胞，即 50 μL（XF96 / XFe96）或 100 μL（XFe24）細胞包含每孔所需要的細胞數(shù)，留 4 個沒有細胞的孔作為背景校正孔。

3. 加入所需的細胞 / 孔，然后溫和地離心使細胞貼壁。

4. 每孔輕輕加入檢測液。實驗前將板子放在 37℃ 無 CO? 的培養(yǎng)箱中孵育 45～60 分鐘。

準備化合物儲液（現(xiàn)配現(xiàn)用）：

1. 輕彈試劑管子確保在打開管子前粉末在管子底部。

2. 按照下表，用適當體積的檢測液重懸每種組分。旋渦震蕩約 1 min 以確?；衔锿耆貞?。

準備加入探針板加藥孔中的化合物：按下表所示，每種化合物各用檢測液配制 3 mL。推薦使用 1.5 μM 的寡霉素和 0.5 μM 的魚藤酮 + 抗霉素 A（終濃度）。

將化合物加入探針板加藥孔中

標準實驗- 在寡霉素和魚藤酮/抗霉素 A 之前沒有急性注射。將化合物加入已水化的探針板加藥孔中：加藥孔 A：寡霉素 加藥孔 B：魚藤酮/抗霉素 A

誘導實驗- 注射一種測試化合物，加入加藥孔 A 中，按如下所示：加藥孔 A：實驗化合物（急性注射）或溶劑對照 加藥孔 B：寡霉素 加藥孔 C：魚藤酮 / 抗霉素 A

運行 XF 實時 ATP 速率測定

安捷倫科技有限公司是生命科學與研究領域的全球領導者，始終致力于提供前沿的分析解決方案與創(chuàng)新技術。在細胞代謝研究領域，安捷倫推出的 Seahorse XF 分析儀被譽為活細胞能量代謝實時檢測的「金標準」，深受全球科研人員及藥物開發(fā)專家的信賴。

該技術不僅能夠實時、無標記地監(jiān)測細胞能量代謝狀態(tài)，更在揭示疾病機制、加速新藥研發(fā)以及推動基礎科學研究中發(fā)揮著關鍵作用，廣泛應用于癌癥研究、免疫代謝、神經科學等多個前沿領域。

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內容策劃：沈佳鈺

內容審核：朱曉芳