衰老是人體各器官的總體機(jī)能隨時(shí)間推移逐漸降低的過程，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜且具有多層級(jí)性，其根源在于各種分子和細(xì)胞損傷的漸續(xù)累積。研究發(fā)現(xiàn)，衰老和慢性病的產(chǎn)生均與過度氧化引起的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等不同程度損傷密切相關(guān)。

通常細(xì)胞處于氧化還原動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，多種抗氧化酶和食物源的有益因子在其中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。減少細(xì)胞過氧化、抑制DNA損傷是促進(jìn)居民健康的重要策略。我國居民日常膳食原材料中，稻米品質(zhì)升級(jí)對(duì)居民營養(yǎng)和健康具有重要意義。有色稻種有益蛋白質(zhì)、多酚類抗氧化成分等相對(duì)普通稻米具有顯著優(yōu)勢(shì)，這些有益成分被人體消化吸收，或進(jìn)一步參與體內(nèi)脂質(zhì)、血糖、氧自由基等代謝調(diào)控，從而在抑制動(dòng)脈硬化、腫瘤等慢性病發(fā)生、促進(jìn)居民健康等方面發(fā)揮功效。

湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院汪海洋、趙玉楠、方慶*等篩選紅米稻中過氧化還原酶編碼基因，針對(duì)大紅谷

OsPrx3

01

紅米稻OsPrx3蛋白的原核表達(dá)

抗氧化酶系對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原相對(duì)平衡能夠發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Prxs是抗氧化酶系中的典型基因家族之一，因其多功能性備受關(guān)注?；诠δ茏⑨專瑥膩喼拊耘嗉t米稻基因組中篩選出編碼Prxs的基因。其中OsPrx3全長CDS為489 bp，為實(shí)現(xiàn)目的基因OsPrx3高量表達(dá)，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增后，借助限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和EcoR I消化產(chǎn)生黏性末端，再經(jīng)分子重組使OsPrx3全長CDS載入pCold I載體冷休克基因cspA啟動(dòng)子（cspA Pro.）下游，成功構(gòu)建目的基因全長CDS融合His-tag的表達(dá)載體pColdI-cspA Pro:OsPrx3（圖1A）。

將對(duì)照空載體pCold I及測(cè)序正確的重組載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21細(xì)胞，16 ℃低溫附加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，分別收集菌體超聲裂解后進(jìn)行SDS-PAGE。如圖1B所示，對(duì)照菌（emVec/Bl）的各個(gè)樣品中均無對(duì)應(yīng)蛋白聚集（泳道1～6）。而重組菌（reVec/Bl）在無論是否有IPTG誘導(dǎo)劑添加的情況下，在全菌樣（泳道7、10）、上清樣（泳道9、12）和沉淀樣（泳道8、11）中均出現(xiàn)目標(biāo)蛋白。OsPrx3的分子質(zhì)量約為24 kDa。比較而言，在0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，重組菌中生成的目的蛋白量更多（泳道10）；沉淀樣中亦出現(xiàn)相應(yīng)蛋白，很可能是目的蛋白的包涵體，但較上清樣中略少。以上結(jié)果表明，在此實(shí)驗(yàn)條件下可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高量表達(dá)和分離。

OsPrx3僅有一個(gè)半胱氨酸，第51位半胱氨酸很可能是支持其酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。分子結(jié)構(gòu)模擬顯示OsPrx3含多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)如折疊和螺旋?？傮w來看，其“類口袋”的分子構(gòu)型及第51位半胱氨酸處于“口袋”底端，為其對(duì)底物或靶標(biāo)的作用提供了空間（圖1C）。

02

OsPrx3的羥自由基清除活性及其關(guān)鍵位點(diǎn)分析

羥自由基是造成氧化損傷的強(qiáng)自由基類型。以純化的OsPrx3蛋白探究其羥自由基清除活性。如圖2所示，在0.5 mg/mL條件下，OsPrx3對(duì)羥自由基清除率雖遠(yuǎn)低于VC，但仍達(dá)到30%以上；隨著質(zhì)量濃度的增加，OsPrx3的羥自由基清除率也顯著提升，在1.0 mg/mL和2.0 mg/mL條件下，OsPrx3的羥自由基清除率分別可達(dá)40%和80%。

陰性對(duì)照BSA的羥自由基清除率為零。而OsPrx3突變體OsPrx3mC51A的羥自由基清除率幾乎接近零，與陰性對(duì)照BSA無顯著差異?？梢姡竽c桿菌表達(dá)OsPrx3蛋白體外對(duì)羥自由基具有相對(duì)較強(qiáng)的清除活性，而第51位半胱氨酸為其關(guān)鍵位點(diǎn)。

03

OsPrx3對(duì)DNA氧化損傷的抑制作用

人體衰老和慢性病的發(fā)生與細(xì)胞過度氧化及DNA氧化損傷密切相關(guān)。為證實(shí)OsPrx3體外抑制DNA氧化損傷的功能，進(jìn)行DNA缺刻實(shí)驗(yàn)。在DTT/Fe3＋/O2反應(yīng)溶液中，羥自由基生成后作用于質(zhì)粒DNA，其鏈斷裂由SF變成NF，兩類DNA分子因構(gòu)象不同而在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)遷移率產(chǎn)生明顯差異。

如圖3所示，體系中無羥自由基產(chǎn)生時(shí)，閉合環(huán)狀超螺旋的pMD18質(zhì)粒DNA（泳道1、2、5、6），即SFDNA遷移率未明顯變化，表明此時(shí)的DNA構(gòu)象與含量未有改變。當(dāng)有羥自由基產(chǎn)生時(shí)，DNA缺刻明顯，NFDNA遷移明顯滯后（泳道3和7）；僅有BSA添加的情況下DNA的缺刻狀態(tài)明顯（泳道3）；而在OsPrx3作用下，NF-DNA較之BSA添加條件下明顯減少（泳道4）。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建缺刻實(shí)驗(yàn)體系，以pMD18進(jìn)行反應(yīng)效果較好，也初步顯示OsPrx3具有抑制DNA氧化損傷的功能。

04

OsPrx3作用的濃度效應(yīng)

為探明OsPrx3抑制DNA氧化損傷的濃度與效率關(guān)系，設(shè)計(jì)OsPrx3濃度梯度實(shí)驗(yàn)。以SF-DNA在pMD18中的相對(duì)含量為OsPrx3抑制效率的參考標(biāo)準(zhǔn)。在50 μL反應(yīng)體系中加入3 μg pMD18質(zhì)粒于37 ℃反應(yīng)2 h后，OsPrx3抑制DNA氧化損傷結(jié)果如圖4所示。在0.06～0.18 μg/μL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OsPrx3對(duì)體系中pMD18氧化損傷抑制作用逐漸增強(qiáng)，SF-DNA相對(duì)含量逐漸從52.9%增加至最高（88.9%）（圖4A、B），在酶質(zhì)量濃度增加2 倍的條件下OsPrx3抑制效率提高了68.1%。隨著OsPrx3質(zhì)量濃度繼續(xù)增加（0.21～0.30 μg/μL），SF-DNA相對(duì)含量分別為70.5%、85.0%和83.0%，雖都維持在70.0%以上，但均低于0.18 μg/μL時(shí)的抑制效應(yīng)（圖4B）?？傮w上，當(dāng)OsPrx3由0.06 μg/μL增至0.18 μg/μL，其對(duì)pMD18氧化損傷的抑制效率可增加至原來的1.7 倍。而當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度最高（0.30 μg/μL）時(shí)，并未產(chǎn)生相應(yīng)最高損傷抑制效應(yīng)。在上述較低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（0.06～0.18 μg/μL），OsPrx3的使用濃度與抑制DNA氧化損傷的效果之間具有較為明顯的量效關(guān)系。

SF-DNA與NF-DNA含量比例（SF/NF值）能夠更直觀反映OsPrx3發(fā)揮的抑制作用。當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度為0.18 μg/μL時(shí)對(duì)應(yīng)最高的SF/NF值；當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL時(shí)SF/NF值高于0.21 μg/μL時(shí)對(duì)應(yīng)的SF/NF值（圖4C）。上述4 個(gè)較低的質(zhì)量濃度梯度下，OsPrx3對(duì)體系中pMD18氧化損傷抑制效率均值為72.8%。而當(dāng)OsPrx3質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL時(shí)，其實(shí)際抑制效率達(dá)77.5%。OsPrx3因具有Cys，其中的S-OH作用體系中羥自由基，能夠發(fā)揮底物DNA損傷抑制作用。根據(jù)“高效-節(jié)約”原則，對(duì)于3 μg底物pMD18，推測(cè)OsPrx3在上述反應(yīng)體系中的最適反應(yīng)質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL。

05

OsPrx3對(duì)DNA氧化損傷的即時(shí)作用

為了探明OsPrx3在最適質(zhì)量濃度條件下（0.15 μg/μL）抑制DNA氧化損傷的時(shí)效性，進(jìn)行時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)。如圖5A、C所示，對(duì)照BSA添加條件下，隨反應(yīng)時(shí)間延長，pMD18中SF-DNA相對(duì)含量明顯降低，由初始15 min的61.7%降至180 min的25.3%。

而在OsPrx3作用下，SF-DNA從30 min時(shí)才開始明顯減少，至180 min時(shí)SF-DNA相對(duì)含量才降至60.4%；若僅以O(shè)sPrx3作用下SF-DNA開始減少為起點(diǎn)，則OsPrx3完全抑制DNA氧化損傷時(shí)間可達(dá)30 min；設(shè)定SF/NF值達(dá)1.0為體系氧化還原平衡點(diǎn)，若以SF-DNA相對(duì)含量開始低于NF-DNA相對(duì)含量視為抑制效應(yīng)解除，即兩者比例不低于氧化還原平衡值1.0時(shí)，則OsPrx3對(duì)DNA氧化損傷抑制作用至少可維持180 min（OsPrx3作用180 min的SF-DNA相對(duì)含量為60.4%，高于相應(yīng)體系中NF-DNA的相對(duì)含量（39.6%），此時(shí)SF/NF值為1.5）（圖5B、C）。

總體上，隨時(shí)間延長原pMD18的氧化損傷均逐漸加重，但OsPrx3對(duì)體系中的原pMD18質(zhì)粒DNA氧化損傷抑制作用更為突出。構(gòu)建以BSA為參照的OsPrx3抑制DNA氧化損傷時(shí)間-相對(duì)含量曲線模型，OsPrx3與BSA在各個(gè)相同時(shí)點(diǎn)的作用效果差異明顯（圖5C）。

06

OsPrx3的作用模型分析

為更好理解OsPrx3的功能及其潛在調(diào)控方式，構(gòu)建其工作模型。如圖6所示，OsPrx3以其分子內(nèi)過氧化活性位點(diǎn)-半胱氨酸殘基上的巰基抵抗過氧化，發(fā)揮DNA氧化損傷抑制作用。其可及時(shí)抑制羥自由基等活性氧的損傷作用，使得體外多數(shù)DNA得到防護(hù)；脫離抑制的自由基等可能造成DNA損傷。汪海洋等研究發(fā)現(xiàn)OsPrx3可顯著抑制線蟲體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)線蟲抵御氧化的能力。若OsPrx3蛋白質(zhì)被攝入，可經(jīng)消化轉(zhuǎn)為不同肽段，再吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮其他調(diào)控功能；或轉(zhuǎn)變?yōu)闈撛诨钚噪亩?，進(jìn)一步發(fā)揮有益作用?；诖?，若進(jìn)一步開發(fā)其功能，可促進(jìn)稻米品質(zhì)升級(jí)或提高其促健康作用。

討論與結(jié)論

紅米稻屬于典型的有色稻，在我國栽培歷史悠久、地域適應(yīng)性廣闊。紅米稻增益健康成分如氨基酸、蛋白質(zhì)等優(yōu)于普通稻米，在我國居民日常膳食中具有重要地位。目前，紅米稻遺傳資源及其中潛在重要功能因子尚待深入發(fā)掘。本研究進(jìn)一步證實(shí)，大紅谷中Prxs基因OsPrx3原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白在體外具有較強(qiáng)抑制DNA氧化損傷的功能。OsPrx3的羥自由基清除率最高可達(dá)80%（圖2）；在質(zhì)量濃度為0.15 μg/μL條件下，OsPrx3對(duì)體外質(zhì)粒DNA氧化損傷抑制率均值可達(dá)75%以上，顯著高于對(duì)照BSA（圖4A、B）。

根據(jù)序列中是否含有第2個(gè)半胱氨酸殘基，Prxs基因家族可分為典型2-Cys Prx、非典型2-Cys Prx和1-Cys Prx亞家族。OsPrx3氨基酸序列中僅含第51位過氧化半胱氨酸，應(yīng)屬于Prxs家族中的1-Cys亞族。通過構(gòu)建定點(diǎn)突變體OsPrx3mC51A，證實(shí)第51位Cys是OsPrx3分子活性的關(guān)鍵位點(diǎn)（圖2）。1-Cys亞族Prx氧化后形成二硫鍵，可通過電子供體還原以恢復(fù)其過氧化還原活性。體外OsPrx3應(yīng)依賴其第51位Cys中S—OH較強(qiáng)的還原活性，消除反應(yīng)體系自由基對(duì)SF-DNA鏈上核苷酸磷酸鍵的破壞，從而發(fā)揮抑制DNA氧化損傷的作用。因此，該酶對(duì)DNA氧化損傷的抑制效應(yīng)主要源于其對(duì)羥自由基等的消除作用。本研究發(fā)現(xiàn)OsPrx3的DNA氧化損傷抑制率最高可達(dá)88.9%；而最適作用濃度下，其維系相對(duì)較高的抑制效應(yīng)可達(dá)180 min之久，而且在前30 min的抑制水平相對(duì)最高，表明其活性在該條件下具有較好的穩(wěn)定性與高效率（圖5），也預(yù)示其可能具有重要應(yīng)用潛能。

DNA氧化損傷以及修復(fù)缺陷可能是衰老和復(fù)雜慢性病產(chǎn)生的重要因素。慢性病通常具有起病隱匿、病因復(fù)雜、病程長且遷延難愈的特點(diǎn)；而身體衰老的同時(shí)會(huì)極大增加慢性病發(fā)生概率。目前老齡人口逐年急劇增加，構(gòu)成慢性病患者的主要群體。總體來看由慢性病帶來的諸多危害仍十分突出，常見的慢性病如心腦血管疾病、癌癥、糖尿病對(duì)老齡人口健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。面向未來深入開發(fā)主要作物中的促健康、抗衰老因子，積極探索和推進(jìn)作物品質(zhì)升級(jí)保障“增進(jìn)健康、延緩衰老”總目標(biāo)達(dá)成，是響應(yīng)“健康老齡化”的重大策略。諸多研究表明，Prxs基因家族在細(xì)胞維持氧化還原狀態(tài)平衡、抑制氧化損傷等方面發(fā)揮重要功能。例如，細(xì)胞內(nèi)Prx1在端粒染色質(zhì)中富集，這與活性氧誘導(dǎo)的端粒損傷相反；而氧化損傷后，基因敲除突變體細(xì)胞中端粒單鏈DNA斷裂增多，導(dǎo)致端粒迅速縮短。另有研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中Prx II缺失，會(huì)顯著加速細(xì)胞衰老。以上研究表明Prxs基因家族能夠參與衰老調(diào)控。

研究人類及其他哺乳動(dòng)物中的Prxs，進(jìn)一步證實(shí)該家族基因的多功能性及應(yīng)用潛力。例如，重組人過氧化物還原酶-5的表達(dá)產(chǎn)物可不直接殺傷目標(biāo)細(xì)胞，卻能夠激活機(jī)體正常的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而控制與清除腫瘤；而鼠源重組過氧化物還原酶-5對(duì)小鼠具有顯著的抗胰腺癌活性。對(duì)過氧化物酶3在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)模型進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)其可能亦參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Yin Wen等發(fā)現(xiàn)棕櫚酸會(huì)抑制小鼠Prx1的活性，由此加重雄性小鼠非酒精性脂肪性肝炎；而研究表明，Prx1在多種人類腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)特征；另外，值得注意的是Prx1的表達(dá)可能受到核因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）調(diào)控。當(dāng)Nrf2被敲除后，細(xì)胞無論是在穩(wěn)態(tài)或缺氧/復(fù)氧應(yīng)激條件下，Prx1基因表達(dá)均出現(xiàn)顯著下調(diào)；蛋白質(zhì)-核酸互作實(shí)驗(yàn)證據(jù)亦顯示在缺氧/復(fù)氧應(yīng)激條件下Prx1啟動(dòng)子區(qū)及其上游順式元件易被Nrf2蛋白結(jié)合。以上研究顯示出Prxs作為相關(guān)腫瘤治療靶向的可能性。

近年來，伴隨基因組學(xué)等科學(xué)研究方法進(jìn)步，植物中的Prx基因家族亦被發(fā)現(xiàn)具有重要調(diào)控功能。Zang Dongtian等研究證實(shí)普通小麥的Prx基因（TaPRX-2A）能夠負(fù)調(diào)控麥穗粒數(shù)量，過表達(dá)目的基因使麥穗粒數(shù)比正常小麥明顯減少。汪海洋等發(fā)現(xiàn)OsPrx3蛋白可影響線蟲氧化應(yīng)激耐受及壽命調(diào)控基因的表達(dá)，如SKN-1在飼喂目的蛋白的線蟲體內(nèi)顯著上調(diào)表達(dá)。該研究也表明OsPrx3對(duì)受試動(dòng)物具有有益作用，其若被動(dòng)物攝入、消化為潛在功能肽段，能夠調(diào)控線蟲的相應(yīng)機(jī)能。SKN-1與機(jī)體的代謝、線蟲衰老和壽命密切相關(guān)，并受胰島素信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)等多途徑調(diào)控，提示OsPrx3蛋白增強(qiáng)動(dòng)物抵御氧化的能力很可能具有復(fù)雜機(jī)制。以上結(jié)果表明，OsPrx3在作物品質(zhì)升級(jí)、促進(jìn)人體健康方面的應(yīng)用潛能。

總之，本研究采用體外DNA缺刻實(shí)驗(yàn)證實(shí)了紅米稻OsPRx3具有較強(qiáng)的抑制DNA氧化損傷功能，為探索紅米稻重要蛋白因子的功能及其運(yùn)用提供了理論基礎(chǔ)。

作者簡(jiǎn)介

通信作者：

方慶，湖北民族大學(xué)副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)橹参锬婢尺m應(yīng)性調(diào)控與蛋白工程。先后主持或參與完成國家自科基金、中國博士后基金及湖北省自然科學(xué)基金等科研項(xiàng)目，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊已發(fā)表研究論文或報(bào)告20余篇。曾獲全國大學(xué)生生命科學(xué)競(jìng)賽優(yōu)秀指導(dǎo)教師等榮譽(yù)。

第一作者：

汪海洋，碩士，工程師；本科和碩士畢業(yè)于湖北民族大學(xué)，碩士研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)，期間發(fā)表研究論文6 篇，曾獲湖北民族大學(xué)研究生獎(jiǎng)學(xué)金。

本文《過氧化物還原酶OsPrx3抑制DNA氧化損傷的功能》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第20期162-169頁，作者：汪海洋，趙玉楠，盧延克，黃卉，王智勇，方慶。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250509-041。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：南伊；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)