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Introduction

非酶糖基化反應(yīng)是指還原糖的羧基與蛋白質(zhì)或肽的游離氨基發(fā)生的親核加成反應(yīng)，其中游離賴氨酸、精氨酸和N端是潛在的糖基化位點(diǎn)。在健康人體內(nèi)，蛋白非酶糖基化反應(yīng)緩慢，但在糖尿病患者中，高血糖會加速血紅蛋白和血清白蛋白的非酶糖基化進(jìn)程。血紅蛋白是胞內(nèi)蛋白，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖會與其發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)。糖基化血紅蛋白是糖尿病患者的重要指標(biāo)，可反應(yīng)血液中2～3個(gè)月內(nèi)的平均血糖水平。相比于血紅蛋白，血清蛋白潛在糖基化位點(diǎn)（賴氨酸和精氨酸殘基）多，更易發(fā)生非酶糖基化，是血清中主要的非酶糖基化蛋白。

人血清白蛋白（HSA）是血液中最豐富的蛋白，具有運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)血漿pH值和脂質(zhì)代謝、維持滲透壓等多種功能。由于HSA半衰期長（14～20 d）且含有大量游離賴氨酸和精氨酸殘基（85個(gè)糖基化位點(diǎn)），易與還原糖發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)。在糖尿病患者中，HSA比其它蛋白質(zhì)更易發(fā)生非酶糖基化，約占血液中總非酶糖基化蛋白的80%。糖基化會改變HSA的二維和三維結(jié)構(gòu)，影響其生物活性，并形成晚期糖基化末期產(chǎn)物（AGEs）、活性氧和羰基等化合物，會對器官和組織造成不可逆的損害。據(jù)報(bào)道，HSA過度糖基化會抑制細(xì)胞葡萄糖攝取和引發(fā)機(jī)體炎癥。此外，體內(nèi)AGEs過度積累會增加心血管疾病、腎臟損傷、阿爾茨海默病和視網(wǎng)膜損傷等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病率。因此，抑制HSA糖基化對于緩解糖尿病及其并發(fā)癥具有重要的意義。

鞣花單寧（ET）廣泛存在于水果和堅(jiān)果中，具有多種生物活性，但其胃腸道吸收率低。在胃和腸道消化階段，ETs會水解產(chǎn)生六羥基二苯甲�；℉HDP）基團(tuán)而轉(zhuǎn)化為鞣花酸（EA）。部分EA在胃腸道被吸收，而未被吸收的EA會被腸道微生物代謝，產(chǎn)生大量的3,8-二羥基-6H-二苯并吡喃-6-酮型衍生物，如尿石素A（UroA）、尿石素B（UroB）、尿石素D（UroD）和尿石素C（UroC）（圖1）。尿石素類化合物（Uros）比ET和EA更易于吸收，且具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗糖尿病和抗肥胖等多種生物活性。然而，ET的代謝產(chǎn)物EA和UroA-D抑制HSA糖基化作用及其分子機(jī)制還尚不明確。

圖1 ET和EA在胃腸道中的代謝示意圖

江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生彭春彥、張露教授和健康學(xué)院謝星博士等，首先評估了EA和UroA-D對HSA非酶糖基化產(chǎn)物生成的抑制作用；其次，采用熒光光譜法等方法探究了EA和UroA-D對糖基化過程中HSA結(jié)構(gòu)的影響；最后，結(jié)合MGO捕獲能力、自由基清除能力和糖基化位點(diǎn)等指標(biāo)闡明EA和UroA-D抑制HSA糖基化的分子機(jī)制。本研究可為EA和Uros作為糖基化抑制劑開發(fā)用于預(yù)防和治療糖尿病提供理論基礎(chǔ)。

Results and Discussion

果糖胺、二羰基化合物、熒光AGEs、游離氨基是蛋白糖基化過程中的關(guān)鍵產(chǎn)物。如圖2所示，EA和UroA-D對HAS糖基化過程中果糖胺的生成無抑制效果，但能顯著抑制二羰基化合物、熒光AGEs的生成，并增加游離氨基酸的含量（P＜0.05），其中EA、UroC和UroD的抑制能力顯著優(yōu)于其它化合物（P＜0.05）。以上結(jié)果表明EA和UroA-D可延緩HSA的非酶糖基化進(jìn)程。

圖2EA和UroA-D對HAS糖基化過程中果糖胺（A）、α-二碳基化合物（B）、熒光性AGEs（C）和游離氨基（D）形成的影響

進(jìn)一步分析了EA和UroA-UroD對HSA糖基化過程中色氨酸、游離巰基等氧化產(chǎn)物形成的影響。如圖3所示，未糖基化和糖基化HSA（G-HSA）的熒光強(qiáng)度分別為148.33和59.64（色氨酸殘基相對含量），表明在G-HSA中有59.79%的色氨酸殘基被氧化（圖3A）。EA和UroD分別使G-HSA熒光值提高了45.00%和54.81%，UroA和UroB 使G-HSA的熒光值顯著降低，而UroC和AG對G-HSA熒光值無顯著影響（P＞0.05）。Uros的抑制能力可能與其二苯并吡喃-6-酮環(huán)上的酚羥基數(shù)目相關(guān)，酚羥基數(shù)目越多，效果越好。如圖3B所示，未糖基化HSA中游離巰基的含量為20.50 μg/mL，糖化后其含量下降至9.95 μg/mL。EA和UroD的游離巰基含量最高，其值分別為17.31和21.96 μg/mL；UroA次之，含量為14.77 μg/mL；UroB和UroC含量最低。以上結(jié)果表明EA和UroA-D能緩解HSA非酶糖基化引起的氧化損傷，UroD的效果最佳。

圖3 EA和UroA-D對HAS糖基化過程中色氨酸殘基（A）和游離巰基含量（B）的影響

非酶糖基化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，通過測定蛋白聚積程度和分子量研究了EA和UroA-D對非酶糖基化HSA結(jié)構(gòu)的影響。如圖4A所示，未糖基化的HSA熒光強(qiáng)度值最低（370.91），糖基化后熒光值增加至588.53，表明糖基化加劇了蛋白質(zhì)的聚集和纖維化。添加EA、UroB和UroD后，G-HSA的熒光值分別下降了28.5%、21.5%和22.8%，UroA、UroC和AG的抑制效果顯著弱于它們（P＜0.05）。由圖4B可知，未糖基化HSA在約68 kDa處有明顯的深色條帶，而G-HSA的深色條帶輕微上移，表明HSA發(fā)生了糖基化反應(yīng)。添加EA、UroC和UroD后，其蛋白條帶顏色加深，表明其可減輕糖基化誘導(dǎo)的HSA分子量增加和條帶分散。以上結(jié)果表明EA和UroA-D可緩解HSA糖基化誘導(dǎo)的蛋白淀粉樣聚集和分子量增加。

圖4 EA和UroA-D對糖基化HSA的纖維狀態(tài)（A）和分子量（B）的影響

分子對接是研究小分子化合物與蛋白質(zhì)大分子之間相互作用的常用方法。HSA的兩個(gè)主要結(jié)合位點(diǎn)為子域IIA和子域IIIA，小分子化合物更傾向于在子域IIIA與HSA結(jié)合。分子對接結(jié)果顯示，EA和UroA-D與HSA的結(jié)合能分別為-44.97、-16.27、-20.43、-7.73和-38.73 kcal/mol，其中EA與HSA的結(jié)合能力最強(qiáng)，其次是UroD。如圖5所示，EA、UroA-D與HSA分別形成了3、2、2、3和3個(gè)氫鍵。此外，EA和UroA-D也可通過Pi-cation和Pi-alkyl相互作用與HSA結(jié)合。以HSA-EA復(fù)合物為例，EA的羥基或醛基與HSA的Arg410、Tyr411和Leu430殘基形成了3個(gè)氫鍵，與Leu407、Leu453、Val433和Arg485殘基形成了Pi-alkyl相互作用。

圖5 EA和UroA-D與HSA相互作用的二維圖譜

為了更好地闡明EA和UroA-D抑制HSA糖基化的機(jī)制，使用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法（nano LC-orbitrap-MS/MS）鑒定了HSA的糖基化肽段和位點(diǎn)。通過與Uniport數(shù)據(jù)庫比對母離子（m/z）和碎片離子（b系列和y系列離子）確定了HSA的糖基化肽段序列及位點(diǎn)。如圖6A所示，肽段290-LKECCEKPLLEK-310的m/z為387.45384+，當(dāng)結(jié)合1和2個(gè)葡萄糖時(shí)，發(fā)生40.5132和81.026 1的質(zhì)量偏移，在427.96684+和468.47994+處出現(xiàn)m/z響應(yīng)值。未糖基化和糖基化模式下，肽段589-ET(CAM)CFAEEGKK-598的m/z分別為400.18423+和454.20173+，m/z的偏移量為54.0171（圖6B），表明肽段589?598結(jié)合了1個(gè)葡萄糖。C8和C9的m/z分別為941.3629和1231.5087，質(zhì)量偏移量為290.1458，表明1分子葡萄糖的結(jié)合在Lys597上。另外，肽段585～598（ADDKETCFAEEGKK，圖6C）具有三個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)（K588、K597和K598），但僅在C4（m/z 609.2679）和C3（m/z 319.1232）、C13（m/z 1822.7571）和C12（m/z 1532.6018）觀察到質(zhì)量偏移為290，表明1分子葡萄糖結(jié)合在Lys588/Lys597殘基，則Lys588/Lys597是糖基化位點(diǎn)。

如表1所示，在G-HSA中鑒定出11個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為Lys130、Lys186、Lys300、Lys305、Lys341、Lys499、Lys549、Lys558、Lys588、Lys597和Lys598。添加EA和UroA-D后，糖基化位點(diǎn)的數(shù)量分別為10、10、11、7和10。添加UroC后，G-HSA糖基化位點(diǎn)Lys186、Lys305、Lys341、Lys499、Lys597和Lys598消失，但新增加了糖基化位點(diǎn)Lys214和Lys569。EA屏蔽了G-HSA中糖基化位點(diǎn)Lys186、Lys305、Lys499和Lys598，新增糖基化位點(diǎn)Lys36、Lys161和Lys438。UroA和UroD的效果類似EA，僅減少1個(gè)糖基化位點(diǎn)。UroB對G-HSA的糖基化位點(diǎn)數(shù)量無影響，但改變了糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列。以上結(jié)果說明EA和UroA-D對HSA的糖基化位點(diǎn)均有影響，且UroC效果最顯著。

圖6 糖基化肽290?310，m/z為468.479 94+（A），糖基化肽589?598，m/z為454.20173+（B）的質(zhì)譜糖基化肽589?598（C）和肽585?598（D）的HCD圖譜

丙二醛（MGO）是典型的二羰基化合物，其能攻擊蛋白質(zhì)的自由氨基形成熒光糖基化終產(chǎn)物（AGEs），捕獲MGO可有效降低熒光性AGEs的形成。因此，評估了EA和UroA-D捕獲MGO的能力，以進(jìn)一步解析EA和UroA-D抑制HSA糖基化的機(jī)制。如圖7A所示，當(dāng)EA和UroA-D的濃度為90 μmol/L時(shí)，其MGO捕獲能力分別為72.92%、7.80%、69.15%、46.37%和89.72%，其中UroD的MGO捕獲能力最強(qiáng)，EA和UroB（P＜0.05）次之，但均顯著強(qiáng)于陽性對照AG（49.99%）。如圖7B和C所示，當(dāng)樣品濃度為250 μmol/L時(shí)，EA、UroC和UroD表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除能力，其清除能力順序?yàn)镋A（76.68%）＞UroD（68.34%）＞UroC（47.24%），而UroA、UroB和AG的DPPH·的清除能力較弱。另外，UroD的ABTS·+清除能力最強(qiáng)，其次為EA和UroC（P＜0.05），UroB最弱。因此可見，EA和UroA-D可通過捕獲MGO、清除DPPH·和ABTS·+達(dá)到抑制HSA糖基化的效果。

圖7 EA和UroA-D的MGO捕獲能力（A）、DPPH（B）和ABTS+清除能力（C）

Conclusion

綜上所述，Uros對G-HSA的抑制與其酚羥基的數(shù)量有關(guān)，其中EA、UroC和UroD的抑制HSA非酶糖基化的能力最強(qiáng)。UroD抑制熒光AGEs形成的能力最強(qiáng)，其抑制率為69.31%。EA和UroD顯著HAS糖基化過程中提高色氨酸殘基、游離氨基和游離巰基水平，減少HSA糖基化導(dǎo)致的淀粉樣蛋白聚集。EA和UroA-D主要通過誘捕MGO、清除DPPH·和ABTS·+自由基和屏蔽糖基化位點(diǎn)等途徑緩解HSA的非酶糖基化進(jìn)程。本研究可為EA和UroA-D作為抗糖基化劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

第一作者

彭春彥，男，現(xiàn)為江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生，主要研究方向天然產(chǎn)物組分與食品組分相互作用。以第一作者在國內(nèi)外期刊發(fā)表論文3篇，其中SCI一區(qū)論文2篇。

通信作者

謝星，男，江西師范大學(xué)健康學(xué)院講師，中共黨員，博士畢業(yè)于華南理工大學(xué)，碩士生導(dǎo)師。主要從事天然植物小分子(多酚類化合物)和大分子(蛋白)之間相互作用與植物中功效成分提取和活性評價(jià)方面的研究。在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論30余篇，其中以第一或通訊作者在Food & Function和LWT等雜志發(fā)表10余篇，主持江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目和江西省教育廳項(xiàng)目各1項(xiàng)；指導(dǎo)學(xué)生獲中國國際“互聯(lián)網(wǎng)+”大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽全國銀獎(jiǎng)、全國大學(xué)生生命科學(xué)競賽二等獎(jiǎng)。

張露，教授，博士生導(dǎo)師，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心副主任，江西省“雙千計(jì)劃”科技創(chuàng)新高端人才，江西省青聯(lián)聯(lián)合會十一屆委員會委員，中國農(nóng)業(yè)工程學(xué)會農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程專業(yè)委員會理事，中國海洋學(xué)會海洋中藥專業(yè)委員會委員江西�。ㄊ”炯墸┨厥馐称芳夹g(shù)專家、江西省青年科技工作者協(xié)會成員等。在功能性食物資源開發(fā)和高值化利用方面開展了系列工作，發(fā)現(xiàn)了動態(tài)高壓微射流技術(shù)輔助提取活性成分的“協(xié)同增效”和“尺寸減小”效應(yīng)；構(gòu)建了藜蒿、甘薯葉等10余種植物資源中主要活性成分的指紋圖譜，以及復(fù)雜體系中抗氧化劑在線篩選方法和酶抑制肽的高通量篩選鑒定方法。主持國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題、國家自然科學(xué)基金等國家和省部級項(xiàng)目10項(xiàng)，主要參與國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金等國家和省部級項(xiàng)目16項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文80余篇，其中SCI論文60余篇，獲省部級科研獎(jiǎng)勵(lì)5項(xiàng)，國家授權(quán)發(fā)明專利17件，指導(dǎo)本科生參加“互聯(lián)網(wǎng)+”大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽、全國大學(xué)生生命科學(xué)競賽等獲國家和省級獎(jiǎng)勵(lì)5項(xiàng)。同時(shí)，通過技術(shù)服務(wù)、聯(lián)合技術(shù)攻關(guān)、產(chǎn)品開發(fā)等對接服務(wù)煌上煌集團(tuán)有限公司、華潤江中、江西德上制藥有限公司、江西倍得力生物工程有限公司等企業(yè)8家。

Effect of ellagitannin metabolites ellagic acid and urolithins A-D on the non-enzymatic glycation of human serum albumin and inhibiting mechanisms

Chunyan Penga, Wenna Zhoua, Xing Xiea,b,*, Feiyan Lua, Linju Xua, Qinghui Wena, Zongcai Tua,c, Lu Zhanga,*

a National R&D Center of Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China

b College of Health, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China

c State Key Laboratory of Food Science and Resources, Nanchang University, Nanchang 330047, China

*Corresponding author.

Abstract

Effect of ellagitannins gut microbiota metabolites ellagic acid (EA) and urolithin A-urolithin D (UroA-UroD) on human serum albumin (HSA) glycation were firstly evaluated in this research. The inhibition mechanisms were investigated by methylglyoxal (MGO) trapping and radical scavenging ability assays, docking studies and nano LC-orbitrap-MS/MS technology. Results indicated that the inhibition of urolithins on HSA glycation was highly positive correlated with the number of phenolic hydroxy groups. Addition of UroD and EA could effectively enhance the content of free amino group, suppress dicarbonyl compounds and advanced glycation end-products (AGEs) formation, alleviated tryptophan and protein oxidation, inhibited HSA amyloid-like aggregation. They could also trap MGO and scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical (DPPH·) and 2,2’-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid free radical (ABTS+·). Molecular docking indicated that EA and UroA-UroD interact with HSA mainly through hydrogen bound and hydrophobic interaction, among which 2 or 3 hydrogen bonds were formed. The number of glycation sites were reduced from 11 to 10, 10, 7, and 10, respectively, when 90 μmol/L of EA, UroA, UroC and UroD were added. However, weak inhibition was observed on UroA and UroB. These findings can provide scientific evidence for the application of ellagitannins-rich foods in alleviating diabetic complications.

Reference:

PENG C Y, ZHOU W N, XIE X, et al. Effect of ellagitannin metabolites ellagic acid and urolithins A-D on the non-enzymatic glycation of human serum albumin and inhibiting mechanisms[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(5): 9250107. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250107.

本文編譯內(nèi)容由作者提供

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

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