周圍神經(jīng)損傷是臨床常見問題，常導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾并造成巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于神經(jīng)軸突再生緩慢、易發(fā)生方向性誤導(dǎo)和突觸錯配，神經(jīng)的自我再生能力難以實現(xiàn)功能恢復(fù)。臨床上，長段神經(jīng)缺損（超過5毫米）的治療尤為棘手。盡管自體神經(jīng)移植被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其面臨著供區(qū)并發(fā)癥和尺寸匹配困難等問題。為應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，組織工程領(lǐng)域發(fā)展了多種神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管，但現(xiàn)有的人工神經(jīng)導(dǎo)管普遍存在成分單一、結(jié)構(gòu)簡單以及缺乏仿生結(jié)構(gòu)等局限性。天然神經(jīng)的多層結(jié)構(gòu)——包括神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜——突顯了復(fù)合結(jié)構(gòu)對于再現(xiàn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的重要性。

近日，中國科學(xué)院蘇州納米所程國勝研究員、郝瑩副研究員與蘇州大學(xué)趙薈菁教授、肖淼副研究員合作，受天然神經(jīng)多層結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，開發(fā)了一種結(jié)合水凝膠和針織絲纖維套管的仿生多層導(dǎo)電神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管，用于周圍神經(jīng)再生。該復(fù)合導(dǎo)管整合了外層絲素蛋白針織套管以提供機(jī)械支撐并模擬神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)、內(nèi)層由絲素蛋白和甲基丙烯酰化明膠組成的多通道水凝膠以促進(jìn)細(xì)胞黏附和神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放，并引入聚吡咯實現(xiàn)電活性調(diào)控。研究表明，SF/GelMA/Ppy/KS復(fù)合導(dǎo)管具有可降解性、導(dǎo)電性、機(jī)械穩(wěn)定性、定向結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出良好的體外和體內(nèi)生物相容性。在大鼠坐骨神經(jīng)長段缺損模型中移植該復(fù)合導(dǎo)管，成功實現(xiàn)了神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。通過將仿生結(jié)構(gòu)與多功能生物材料相結(jié)合，該研究為長段神經(jīng)再生提供了一種有前景的人工神經(jīng)導(dǎo)管。相關(guān)論文以“Bioinspired Multilayered Conductive Nerve Guidance Conduit Built on Hydrogels and Knitted Silk Fiber Sleeves for Peripheral Nerve Regeneration”為題，發(fā)表在

ACS Nano

圖1： 具有人工仿生神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)的雙網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)電水凝膠神經(jīng)導(dǎo)管的復(fù)合支架示意圖，將其移植到坐骨神經(jīng)橫斷部位用于神經(jīng)修復(fù)和再生。

研究團(tuán)隊首先詳細(xì)展示了SF/GelMA/Ppy/KS復(fù)合導(dǎo)管的制備過程和多尺度結(jié)構(gòu)特征（圖2）。宏觀照片顯示，長度為10毫米的復(fù)合導(dǎo)管結(jié)構(gòu)完整；掃描電鏡觀察揭示了內(nèi)部的多微通道水凝膠結(jié)構(gòu)，這種設(shè)計有助于引導(dǎo)軸突再生并促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)。外層絲素蛋白針織套管在浸涂前纖維較為松散、孔隙不規(guī)則，經(jīng)過絲素蛋白/聚環(huán)氧乙烷/甘油浸涂后，絲纖維表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和規(guī)整性，形成了類似于天然坐骨神經(jīng)外膜膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的分級互聯(lián)纖維結(jié)構(gòu)。力學(xué)測試表明，浸涂后的針織套管保持了88.4 ± 0.7 MPa的高斷裂強(qiáng)度，斷裂伸長率約為45%，與天然神經(jīng)外膜的生理斷裂伸長率相當(dāng)。值得注意的是，PPy的引入增強(qiáng)了水凝膠的力學(xué)和電學(xué)性能，SF/GelMA/Ppy水凝膠的壓縮模量較純SF或GelMA水凝膠顯著提高，電導(dǎo)率達(dá)到1.1×10?2 ± 1.3×10?3 S/cm，處于天然神經(jīng)組織的生理電導(dǎo)率范圍內(nèi)。LED燈泡點亮實驗進(jìn)一步證實了其導(dǎo)電性。此外，SF/GelMA/Ppy水凝膠表現(xiàn)出232.5 ± 47.1%的溶脹率和適宜的降解特性，與KS復(fù)合后溶脹率降低至126.9 ± 16.4%，表明外層KS結(jié)構(gòu)限制了內(nèi)部水凝膠的溶脹。

圖2： 復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管的制備、表征、掃描電子顯微鏡觀察及性能。（a）SF/GelMA/Ppy/KS導(dǎo)管制備示意圖。（b）SF/GelMA/Ppy/KS導(dǎo)管的照片。（c）SF/GelMA/Ppy水凝膠的橫截面。（d）SF/GelMA/Ppy水凝膠的縱截面。（e）未浸涂針織套管的掃描電鏡圖。（f）浸涂后針織套管的掃描電鏡圖。（g）未浸涂針織套管和浸涂針織套管的拉伸性能。（h）未浸涂針織套管和浸涂針織套管的彈性模量。（i）不同水凝膠的壓縮性能（SF、GelMA、SF/GelMA、SF/GelMA/Ppy水凝膠）。（j）不同水凝膠的壓縮模量。（k）SF/GelMA/Ppy水凝膠的導(dǎo)電性（LED燈）。（l）不同材料的導(dǎo)電性（SF、GelMA、SF/GelMA、SF/GelMA/Ppy、SF/GelMA/Ppy/KS）。（m）不同水凝膠的溶脹性能。（n）不同水凝膠的降解速率。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統(tǒng)計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001表示顯著性差異。

在體外生物相容性評估中（圖3），研究團(tuán)隊將施萬細(xì)胞接種于不同支架材料上培養(yǎng)。三維共聚焦圖像顯示，施萬細(xì)胞在整個神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)鋪展和生長，活/死染色證實四種支架上的細(xì)胞存活率均超過95%，這主要歸功于SF、GelMA和PPy優(yōu)異的生物相容性。免疫熒光染色結(jié)果顯示，SF/GelMA/Ppy組細(xì)胞S100蛋白表達(dá)水平顯著高于其他組，這可能歸因于PPy的導(dǎo)電性模擬了神經(jīng)電生理微環(huán)境，激活了與施萬細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞向成熟施萬細(xì)胞分化。四組細(xì)胞中GFAP均呈低水平表達(dá)，且組間無顯著差異。體內(nèi)生物相容性實驗將SF/GelMA/Ppy/KS支架植入SD大鼠下肢肌肉，12周后HE和Masson染色未見明顯炎癥反應(yīng)，肌肉組織長入支架內(nèi)部，表明該復(fù)合支架具有良好的組織相容性。

圖3： 不同支架上施萬細(xì)胞的體外培養(yǎng)。（a）施萬細(xì)胞接種于神經(jīng)導(dǎo)管支架的示意圖，包括生長、遷移和延伸突起。（b）培養(yǎng)第3天，F(xiàn)ITC和DAPI標(biāo)記的施萬細(xì)胞在SF/GelMA/Ppy支架上生長和分布的三維共聚焦圖像。比例尺：500 μm。（c）活細(xì)胞（鈣黃綠素-AM，綠色）和死細(xì)胞（碘化丙啶，紅色）的代表性圖像。比例尺：100 μm。（d）來自（c）的細(xì)胞活力統(tǒng)計。（e，f）S100和GFAP的代表性免疫熒光圖像。比例尺：200 μm。（g，h）來自（e）和（f）的免疫熒光結(jié)果統(tǒng)計。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統(tǒng)計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，*p < 0.05，**p < 0.01表示顯著性差異。

為評估再生神經(jīng)的功能恢復(fù)情況（圖4），研究團(tuán)隊測定了復(fù)合肌肉動作電位。結(jié)果顯示，SF/GelMA/Ppy移植組較橫斷組顯著改善了神經(jīng)沖動傳導(dǎo)功能，其CMAP振幅（約5 mV）略低于正常對照組（約3 mV），表明SF/GelMA/Ppy能夠在移植后發(fā)揮神經(jīng)沖動傳導(dǎo)作用。通過步態(tài)分析評估坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，SF/GelMA/Ppy/KS組和自體移植組的SFI評分高于SF/GelMA/Ppy組，且SF/GelMA/Ppy/KS組與自體移植組間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。腓腸肌形態(tài)分析顯示，所有手術(shù)側(cè)均出現(xiàn)一定程度的肌肉萎縮，但SF/GelMA/Ppy/KS組和自體移植組的肌肉萎縮程度較輕，腓腸肌濕重恢復(fù)率相近，膠原纖維增生較少。這些結(jié)果表明，SF/GelMA/Ppy/KS神經(jīng)導(dǎo)管支架的植入促進(jìn)了坐骨神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)，KS因其與神經(jīng)外膜的結(jié)構(gòu)相似性，在支持、保護(hù)、營養(yǎng)供應(yīng)和免疫屏障方面發(fā)揮了重要作用。

圖4： 大鼠坐骨神經(jīng)和腓腸肌的體內(nèi)形態(tài)和功能評估。（a）復(fù)合肌肉動作電位信號采集示意圖。（b）該圖描述了當(dāng)在生物神經(jīng)末端引入外部電壓偏移時，通過不同類型神經(jīng)傳遞的電壓如何隨時間演變。（c）CMAP的峰值振幅。（d）12周后模型大鼠的步態(tài)分析。比例尺：5 mm。（e）來自（d）的大鼠模型坐骨神經(jīng)功能指數(shù)。（f）12周后分離的模型大鼠腓腸肌。比例尺：1 cm。（g）來自（f）的模型大鼠腓腸肌濕重比統(tǒng)計。（h）手術(shù)側(cè)腓腸肌橫截面的Masson三色染色代表性圖像。比例尺：100 μm。（i）來自（h）的膠原纖維面積定量分析。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統(tǒng)計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，****p < 0.0001表示顯著性差異。

研究團(tuán)隊進(jìn)一步對再生神經(jīng)的組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行了多模式技術(shù)評估（圖5）。術(shù)后12周，SF/GelMA/Ppy/KS組再生神經(jīng)較SF/GelMA/Ppy組更粗。HE染色顯示，SF/GelMA/Ppy/KS組再生神經(jīng)纖維生長密度更高、再生組織面積更大，表明KS能增強(qiáng)施萬細(xì)胞增殖和神經(jīng)再生能力。甲苯胺藍(lán)染色顯示，SF/GelMA/Ppy/KS組施萬細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)高于SF/GelMA/Ppy組，接近自體移植組。透射電鏡觀察顯示，SF/GelMA/Ppy/KS組有髓軸突直徑（3.2 ± 0.4 μm）和髓鞘厚度（650.7 ± 95.19 nm）均顯著高于SF/GelMA/Ppy組，與自體移植組相近。G-比值（軸突直徑與神經(jīng)纖維總直徑之比）在SF/GelMA/Ppy/KS組（0.72 ± 0.05）和自體移植組（0.73 ± 0.05）相近，表明SF/GelMA/Ppy/KS組在神經(jīng)信號傳導(dǎo)功能、形態(tài)重建和神經(jīng)再生方面優(yōu)于SF/GelMA/Ppy組。

圖5： 通過多模式技術(shù)揭示修復(fù)后坐骨神經(jīng)的組織形態(tài)學(xué)。（a）動物實驗操作流程示意圖。（b）植入后12周再生坐骨神經(jīng)的照片。比例尺：5 mm。（c）12周后再生神經(jīng)組織橫切面的HE染色圖像。右側(cè)比例尺：50 μm。（d）再生神經(jīng)縱切面的TB染色圖像。左側(cè)比例尺：500 μm，右側(cè)比例尺：100 μm。（e）移植后12周再生神經(jīng)纖維的代表性TEM圖像。左側(cè)比例尺：100 μm，右側(cè)比例尺：5 μm。（f）來自TB染色的施萬細(xì)胞密度定量分析。（g-i）有髓軸突直徑、髓鞘厚度和G-比值的定量分析。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統(tǒng)計分析（每組n=3），ns表示無顯著差異，p < 0.01，p < 0.001，***p < 0.0001表示顯著性差異。

免疫熒光組織化學(xué)分析（圖6）進(jìn)一步證實了SF/GelMA/Ppy/KS對神經(jīng)修復(fù)再生的促進(jìn)作用。SF/GelMA/Ppy/KS組中軸突相關(guān)蛋白NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的熒光分布和陽性率均顯著高于SF/GelMA/Ppy組，與自體移植組相似，表明該組再生神經(jīng)對軸突再生、神經(jīng)分化和成熟具有積極作用。在髓鞘修復(fù)方面，MBP染色顯示SF/GelMA/Ppy/KS組MBP表達(dá)增強(qiáng)，髓鞘連續(xù)致密。在瘢痕和炎癥調(diào)節(jié)方面，SF/GelMA/Ppy/KS組相較于SF/GelMA/Ppy組，促炎細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)顯著下調(diào)，抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)上調(diào)，促瘢痕生物標(biāo)志物α-SMA、Col-I、TGF-β1表達(dá)降低。這些結(jié)果表明，KS通過調(diào)節(jié)局部炎癥微環(huán)境抑制瘢痕形成，引導(dǎo)定向和完全的軸突生長，促進(jìn)髓鞘成熟。

圖6： 術(shù)后12周再生坐骨神經(jīng)的免疫熒光組織學(xué)分析。（a-d）NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的免疫組織化學(xué)染色圖像。（e-h）NF200、S100、Tuj-1、GFAP、GAP43、MAP2和NeuN的定量分析。（i-k）MBP（髓鞘修復(fù)標(biāo)志物）、IL-10和TNF-α（炎癥相關(guān)標(biāo)志物）以及α-SMA、Col-I和TGF-β1（瘢痕相關(guān)標(biāo)志物）的免疫組織化學(xué)染色圖像。（l-q）MBP、IL-10、TNF-α、α-SMA、Col-I和TGF-β1的定量分析。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；Tukey事后檢驗后采用單因素方差統(tǒng)計分析（每組n=6），ns表示無顯著差異，p < 0.01，p < 0.001，***p < 0.0001表示顯著性差異。

綜上所述，該研究通過結(jié)合絲素蛋白針織套管和多微通道SF/GelMA/Ppy水凝膠，成功構(gòu)建了一種仿生復(fù)合神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管，以應(yīng)對長段周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。其分層結(jié)構(gòu)模擬了天然神經(jīng)的機(jī)械支持和電活性微環(huán)境，而SF/GelMA基質(zhì)構(gòu)建了生物活性ECM模擬微環(huán)境，為神經(jīng)再生創(chuàng)造了有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，該導(dǎo)管具有適宜的機(jī)械穩(wěn)定性和導(dǎo)電性，能夠支持施萬細(xì)胞增殖。針織KS在防止瘢痕干擾和促進(jìn)有序軸突生長方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而導(dǎo)電水凝膠加速細(xì)胞和電信號傳導(dǎo)。在大鼠5毫米坐骨神經(jīng)缺損模型中，SF/GelMA/Ppy/KS組表現(xiàn)出顯著改善的功能恢復(fù)。這種仿生復(fù)合神經(jīng)引導(dǎo)導(dǎo)管為周圍神經(jīng)再生提供了一種有前景的策略。