在自然界中，生物分子凝聚體通過刺激觸發(fā)的多階段相變來響應(yīng)外部應(yīng)激。然而，現(xiàn)有的合成凝聚體通常依賴于溶劑或離子強度的變化來驅(qū)動多階段轉(zhuǎn)變，這種依賴性阻礙了在生理條件下實現(xiàn)連續(xù)、可逆的相變，從而限制了其在實際應(yīng)用中的相編程能力。這一局限性主要源于合成系統(tǒng)缺乏動態(tài)模塊結(jié)構(gòu)域，無法在全局相調(diào)控過程中協(xié)調(diào)其組裝途徑。

近日，上海交通大學(xué)馮傳良教授、宋陽副教授合作，報道了一類由低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域衍生出的短肽合成子（分子量約1500道爾頓）。這些肽合成子在單體、自凝聚體、液晶和半結(jié)晶固體凝膠之間表現(xiàn)出熱可逆的四重相變。機理研究揭示，這些相變由凝聚和纖顫化兩種不同的組裝途徑共同調(diào)控，它們以協(xié)同和競爭的方式相互作用。通過修飾肽序列或分子結(jié)構(gòu)，可以精確控制相變溫度，使多階段相變能夠在體溫（37°C）下由劑量依賴的病理信號（如乳酸）激活。相關(guān)論文以“Multistage Phase Programming in Fibrillated Peptide Coacervates”為題，發(fā)表在

Nature Communications

研究人員從天然低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域中選擇了代表性的LARKS基序（-GGYGGG-），將其作為動態(tài)“粘合劑”整合到四苯乙烯標(biāo)記的相分離肽中，合成了名為“LPD”的短肽衍生物。當(dāng)將LPD（5 mg/ml）溶解在熱鹽水溶液中并以0.1°C/min的速率緩慢冷卻時，研究團隊觀察到一系列顯著的多階段相變：在55°C時，透明溶液中首先成核出亞穩(wěn)的凝聚體液滴；隨著溫度降至53°C，這些液滴轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂须p折射特性的液晶相；當(dāng)溫度降至39°C以下時，最終固化為微米級凝膠。凝聚體和液晶相都表現(xiàn)出時間依賴的融合和光漂白后熒光恢復(fù)，證實了其液體特性，而凝膠相則不具備這些特性。掃描電鏡觀察顯示，凝聚體呈現(xiàn)無定形形態(tài)，而液晶相和凝膠相則呈現(xiàn)出纖維狀納米結(jié)構(gòu)，且多數(shù)納米纖維具有優(yōu)先取向，這與Onsager理論和液-液晶相分離模型相符。

圖1： LARKS編碼的肽衍生物在緩慢冷卻過程中表現(xiàn)出多階段相變。(a) 分子結(jié)構(gòu)示意圖。明場和偏光顯微鏡揭示了從單體→凝聚體(b)→液晶(d)→固體凝膠(f)的多階段轉(zhuǎn)變。液滴融合用虛線圓圈標(biāo)出。凝聚體(c)、液晶(e)和固體凝膠(g)的SEM圖像。(h和i)凝聚體、液晶和固體凝膠的FRAP測試（用羅丹明紅染色）。(j)液晶和固體凝膠的流變學(xué)性質(zhì)，其中G'（儲能模量）和G"（損耗模量）作為角頻率的函數(shù)繪制。LPD濃度，5 mg/ml。

為了理解纖顫化在相變中的作用，研究人員使用淀粉樣蛋白特異性染料ThT對體系進(jìn)行染色。隨著溫度從60°C降至30°C，分散相中的ThT熒光顯著增強，表明β-折疊纖維的形成增加。纖顫化動力學(xué)研究表明，在30-40°C的低溫條件下纖顫化進(jìn)程更快。在整個熱循環(huán)過程中，分散相的雙折射強度與熱可逆纖顫化同步變化。通過系統(tǒng)改變LPD濃度，研究團隊繪制了相圖，顯示LLPS的臨界濃度約為0.07 mg/ml，且隨著濃度增加，凝聚體相的溫度窗口逐漸縮小，而液晶相的溫度窗口擴大，表明在高濃度下纖顫化在驅(qū)動相變中發(fā)揮更重要的作用。

圖2： 熱響應(yīng)性纖顫化推動凝聚體中的無序-有序轉(zhuǎn)變。(a) 無序-有序轉(zhuǎn)變示意圖。(b) 熒光顯微鏡圖像揭示液滴內(nèi)纖顫化（ThT，綠色）逐步增強，促進(jìn)偏光下的液晶形成。虛線圓圈表示明場下的液滴位置。(c) 給定溫度下的纖顫化動力學(xué)研究。(d) LPDs的熱可逆纖顫化，如標(biāo)準(zhǔn)ThT熒光測定所示，與液晶的可逆形成相關(guān)(e)。(f) 顯示多階段轉(zhuǎn)變的相圖。冷卻速率，0.1°C/min。(g) 水混合物中纖顫化水平作為溫度和LPD濃度的函數(shù)量化。擬合曲線代表LLPS、液-液晶相分離和液-固相分離的計算邊界。重復(fù)次數(shù)：n = 6。

進(jìn)一步研究表明，多階段相變受到“無序凝聚”和“有序纖顫化”兩種途徑的協(xié)同與競爭調(diào)控。在緩慢冷卻速率下（0.1-1°C/min），凝聚體首先成核，作為液體儲庫濃縮單體并啟動纖顫化，促進(jìn)從凝聚體到液晶相的轉(zhuǎn)變。而在快速冷卻速率下（10-102°C/min），凝聚體的生長受到動力學(xué)抑制，產(chǎn)生亞微米級的小凝聚體，纖顫化過程在低溫下主導(dǎo)自組裝，形成“串珠狀”結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致雙折射強度顯著降低。

圖3： 凝聚和纖顫化的競爭性組裝途徑支配著多階段相變。(a–d)不同冷卻速率下LPDs的SLCM圖像和(e–h)纖絲（ThT，綠色）的分布。(i–l) SEM圖像顯示肽組裝體的形貌。隨著冷卻速率增加，液滴中的纖顫化水平相對于連續(xù)相中的纖顫化水平下降(m和n)。(o)不同冷卻速率下雙折射強度的變化，插圖顯示樣品的偏光顯微鏡圖像。重復(fù)次數(shù)：n = 6。

通過對LPD序列進(jìn)行系統(tǒng)修飾，研究團隊實現(xiàn)了對多階段相變溫度的精確調(diào)控。將陽離子精氨酸替換為賴氨酸或組氨酸，LLPS的臨界溫度隨陽離子-π/π-π相互作用的強度變化而改變，液晶和凝膠的形成溫度也同步變化。將陰離子天冬氨酸替換為谷氨酸或谷氨酰胺，對相變溫度影響較小。在LARKS基序中替換芳香族氨基酸，將酪氨酸替換為疏水性更強的苯丙氨酸會顯著提高各相變溫度，而替換為親水性更強的絲氨酸則降低相變溫度，但絲氨酸的小側(cè)鏈允許更緊密的堆積，在凝膠相中表現(xiàn)出更高的纖顫化程度。

圖4： 基于序列的調(diào)控控制多階段相變的臨界溫度。(a–c) LPD中陽離子氨基酸的取代。(a) 光密度測量作為冷卻函數(shù)。顯示了不同取代的明場和偏光顯微鏡圖像(b和c)。(d–f) 離子氨基酸的替換對相變影響最小。(g–i) LARKS中芳香族氨基酸的替換。LPD濃度固定為5 mg/ml。冷卻速率，1°C/min。比例尺，10 μm。

最后，研究團隊探索了這些LPDs在疾病信號檢測和藥物釋放方面的應(yīng)用潛力。乳酸是一種疾病標(biāo)志物，在病變組織中過表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TPE-RGGYGGGSDG和TPE-HGGYGGGSDG兩種肽對乳酸表現(xiàn)出不同的敏感性：前者在30、100和300 mM乳酸濃度下發(fā)生凝膠→液晶→凝聚體→單體的逐步相變，而后者在2 mM和5 mM的低濃度乳酸下即可實現(xiàn)液晶→凝聚體→單體轉(zhuǎn)變，敏感性提高約50倍。在載藥釋放實驗中，預(yù)先裝載阿霉素的TPE-RGGYGGGSDG凝膠在不同乳酸濃度下表現(xiàn)出依賴相態(tài)的藥物釋放動力學(xué)。

圖5： LPDs被編程為對疾病信號檢測和響應(yīng)性藥物釋放具有可調(diào)敏感性。(a) 信號觸發(fā)的多階段相變示意圖。(b) TPE-RGGYGGSDG和(c) TPE-HGGYGGSDG在多階段相變過程中對乳酸表現(xiàn)出不同的敏感性。比例尺，25 μm。(d和e)通過改變?nèi)樗釢舛确謩e檢測兩種LPD組裝體中的纖顫化水平。(f) TPE-RGGYGGSDG組裝體響應(yīng)乳酸釋放抗腫瘤藥物阿霉素。LAC濃度分別為0、30、100、300 mM。所有實驗均在37°C、150 mM NaCl溶液中進(jìn)行。重復(fù)次數(shù)：n = 4。

總結(jié)與展望：本研究展示了一類具有多階段相變的LARKS編碼肽衍生物，其特征是從溶解單體到自凝聚體、再到液晶、最終到固體凝膠的逐步演變。定量分析揭示了這些轉(zhuǎn)變由纖顫化和凝聚兩種組裝途徑以協(xié)同和競爭的方式共同驅(qū)動。通過改變LPD序列和化學(xué)修飾，可以精確調(diào)控多階段相變，實現(xiàn)在37°C下對熱信號和生化信號（如乳酸）的程序化、多步驟響應(yīng)。盡管LPDs為智能相編程提供了一個有前景的平臺，但要推進(jìn)其實際應(yīng)用，仍需解決幾個挑戰(zhàn)。未來的研究應(yīng)集中于闡明其對生化信號響應(yīng)的特異性，減少非特異性吸附分子的干擾，并最終在復(fù)雜組織環(huán)境和疾病模型中驗證其作為智能生物材料的功能。