蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的微觀解析，是生物技術(shù)領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)，而多肽作為蛋白質(zhì)的重要組成單元，其高效檢測(cè)與分析更是蛋白研究的核心環(huán)節(jié)。近年來，基于納米孔技術(shù)的多肽與蛋白質(zhì)表征被視為最具潛力的下一代蛋白解析方案之一。然而，樣品制備難、分子操控復(fù)雜、信號(hào)解析不易等難題，一直制約著納米孔技術(shù)在多肽檢測(cè)領(lǐng)域的落地應(yīng)用。

針對(duì)上述技術(shù)瓶頸，華大生命科學(xué)研究院牽頭建設(shè)的基因組多維解析技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提出了一種新的解決方案，成功讓現(xiàn)有成熟的納米孔測(cè)序設(shè)備直接具備高通量多肽檢測(cè)的能力。

文章截圖

具體來說，華大團(tuán)隊(duì)從技術(shù)底層創(chuàng)新突破，設(shè)計(jì)出了一套適配現(xiàn)有納米孔測(cè)序芯片的全新解決方案。團(tuán)隊(duì)以DNA作為牽引分子，借助解旋酶帶動(dòng)多肽穩(wěn)定通過納米孔。同時(shí)，為實(shí)現(xiàn)多肽與DNA的快速高效偶聯(lián)，團(tuán)隊(duì)采用修飾試劑對(duì)天然多肽末端進(jìn)行疊氮化修飾，構(gòu)建出“核酸-多肽-核酸”的“三明治”文庫結(jié)構(gòu)（OPO 文庫）。這一文庫制備技術(shù)從天然多肽或蛋白質(zhì)起始，操作簡便高效，完美銜接現(xiàn)有納米孔測(cè)序設(shè)備，打破了樣品制備的瓶頸。

（左）OPO文庫制備流程示意圖：天然多肽經(jīng)疊氮化修飾后，與具有點(diǎn)擊化學(xué)修飾基團(tuán)的DNA模板進(jìn)行快速偶聯(lián)并純化獲得OPO文庫。（右）與現(xiàn)有納米孔設(shè)備適配的高通量多肽傳感體系示意圖。

本工作所使用的納米孔陣列芯片本身具備高通量數(shù)據(jù)產(chǎn)出能力，每小時(shí)可產(chǎn)出超10萬條有效檢測(cè)數(shù)據(jù)，為復(fù)雜的多肽傳感信號(hào)解析奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，源自同一種多肽的電流信號(hào)在呈現(xiàn)多樣性的同時(shí)，亦展現(xiàn)出高度一致的電流趨勢(shì)，這些信號(hào)的疊加圖構(gòu)成了一幅類似“密度矩陣”的指紋圖譜，揭示了多肽通過納米孔時(shí)的主要信號(hào)特征。

實(shí)驗(yàn)表明，這一圖譜對(duì)多肽中氨基酸的電性、體積、極性等變化高度敏感，能夠檢測(cè)單氨基酸位點(diǎn)突變、位置異構(gòu)以及磷酸化等翻譯后修飾引起的細(xì)微改變。結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類和密度矩陣過濾技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種天然多肽的準(zhǔn)確區(qū)分，解決了納米孔信號(hào)解析的關(guān)鍵難題。

（左上）以多肽Pep1為例，將2萬張多肽傳感信號(hào)疊加后，形成獨(dú)特的信號(hào)趨勢(shì)分布。（左下）通過算法模擬，將疊加信號(hào)的密度分布轉(zhuǎn)化為可量化的密度矩陣。（右）自動(dòng)化算法處理流程。

基于該技術(shù)對(duì)相似多肽的高區(qū)分度，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了其實(shí)際應(yīng)用潛力。在抗體研究領(lǐng)域，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)OPO文庫的檢測(cè)數(shù)據(jù)產(chǎn)出比例與抗體親和力呈正相關(guān)。利用這一量化關(guān)系，研究團(tuán)隊(duì)首次在納米孔測(cè)序設(shè)備上實(shí)現(xiàn)了抗原線性表位的鑒定及抗體親和力的半定量比較。

此外，在蛋白質(zhì)鑒定領(lǐng)域，針對(duì)三種人源蛋白開展的單盲實(shí)驗(yàn)中，團(tuán)隊(duì)通過蛋白質(zhì)酶切、文庫制備及肽段識(shí)別，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)種類的準(zhǔn)確判定，驗(yàn)證了這一端到端方案的可靠性，為拓展納米孔測(cè)序儀的應(yīng)用領(lǐng)域奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

（上）將覆蓋C肽全長的六條短肽制備成等比例混合OPO文庫，并用不同的抗體進(jìn)行富集，通過富集比例差異，驗(yàn)證了商業(yè)化抗體對(duì)應(yīng)的真實(shí)表位信息。（下）利用Anti-FLAG抗體對(duì)不同的FLAG突變體進(jìn)行富集并構(gòu)建OPO文庫，通過富集比例評(píng)估了不同突變體的親和力強(qiáng)弱。

文章共同第一作者、華大生命科學(xué)研究院陳俊毅博士指出：“我們通過整合溫和高效的OPO文庫制備策略與自動(dòng)化的數(shù)據(jù)分析流程，依托納米孔高通量傳感平臺(tái)，攻克了納米孔蛋白質(zhì)分析中通量低、天然樣品文庫制備難、信號(hào)解析復(fù)雜等行業(yè)難題。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)肽段的高精度區(qū)分，還可拓展應(yīng)用于抗體表位確定、親和力半定量評(píng)估、天然蛋白質(zhì)鑒定等場(chǎng)景，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了可靠的技術(shù)路徑?！?/p>

談及技術(shù)的未來發(fā)展，本文通訊作者、華大集團(tuán)首席研究員、基因組多維解析技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任徐訊表示：“未來，我們將繼續(xù)聚焦多肽直接檢測(cè)，從蛋白指紋圖譜分析起步，逐步搭建高通量親和力篩選平臺(tái)，并將其推進(jìn)至活性多肽發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域；同時(shí)借助靶向富集策略，實(shí)現(xiàn)間接靶標(biāo)檢測(cè)，借助納米孔設(shè)備的高靈敏度，將難以直接檢測(cè)的生物分子轉(zhuǎn)化為可讀信號(hào)，從而將納米孔檢測(cè)平臺(tái)打造成一個(gè)覆蓋更廣、靈敏度更高的多組學(xué)分析平臺(tái)，為生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域提供更強(qiáng)大的技術(shù)支撐?！?/p>

基因組多維解析技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室徐訊研究員、董宇亮研究員和華大集團(tuán)劉斯奇研究員為本文共同通訊作者，王冀博士、陳俊毅博士、潘海林研究員、羅鳳琴和秦文兵博士為該論文共同第一作者。該工作獲得了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、深圳市科創(chuàng)委和浙江省科技廳省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的資助，以及基因組多維解析技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和武漢華大生命科學(xué)研究院的大力支持。

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