近年來(lái)，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在遺傳病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，并已逐步進(jìn)入臨床試驗(yàn)。然而，目前的安全評(píng)估主要聚焦于基因編碼區(qū)的脫靶突變效應(yīng)，對(duì)于占人類基因組97%以上的非編碼區(qū)域可能帶來(lái)的復(fù)雜影響，科學(xué)界的認(rèn)知尚顯不足。非編碼區(qū)富含大量順式調(diào)控元件，它們通過(guò)遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用等方式，對(duì)維持細(xì)胞 identity 至關(guān)重要。這些調(diào)控元件的任何微小擾動(dòng)，都可能對(duì)細(xì)胞命運(yùn)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，因此，深入探究基因編輯在非編碼區(qū)可能引發(fā)的后果，對(duì)于保障該技術(shù)的安全應(yīng)用具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

2026年2月24日，清華大學(xué)張學(xué)工、李寅青和朱明在《Cell Stem Cell》期刊上發(fā)表了一項(xiàng)題為《Minimizing far-extending chromatin perturbation in genome editing preserves stem cell identity》的研究。該研究的通訊作者包括清華大學(xué)的。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)開(kāi)發(fā)一種名為AR-seq的新技術(shù)，系統(tǒng)性地揭示了CRISPR基因編輯在非編碼區(qū)切割時(shí)，會(huì)在不同細(xì)胞類型中引發(fā)程度各異的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)擾動(dòng)，并發(fā)現(xiàn)這種擾動(dòng)在干細(xì)胞中尤為顯著，可導(dǎo)致其 prematurely 分化，失去干細(xì)胞特性。

為了深入研究這一現(xiàn)象，研究團(tuán)隊(duì)首先利用AR-seq技術(shù)對(duì)多種細(xì)胞類型進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，CRISPR編輯后，染色質(zhì)的開(kāi)放性在切割位點(diǎn)附近發(fā)生顯著變化，且其影響范圍在不同細(xì)胞間差異巨大。例如，在HEK293T細(xì)胞中，染色質(zhì)開(kāi)放范圍的擴(kuò)展僅約6千堿基，而在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3中，這一范圍可延伸至數(shù)百千堿基?；诖耍瑘F(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)“染色質(zhì)擾動(dòng)范圍指數(shù)”，該指數(shù)與細(xì)胞內(nèi)在的DNA修復(fù)通路偏好性密切相關(guān)。值得注意的是，具有干性的細(xì)胞，如小鼠胚胎干細(xì)胞和受精卵，其擾動(dòng)范圍指數(shù)最高，意味著它們對(duì)編輯引發(fā)的染色質(zhì)改變最為敏感。

隨后，研究人員在活體小鼠和體外細(xì)胞模型中驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)。他們將CRISPR系統(tǒng)遞送至小鼠海馬體的神經(jīng)干細(xì)胞中，在距離調(diào)控元件幾十千堿基以外的非編碼區(qū)進(jìn)行切割。結(jié)果顯示，這些編輯事件足以激活靜息的神經(jīng)干細(xì)胞，促使其過(guò)早地分化為神經(jīng)母細(xì)胞，破壞了干細(xì)胞的正常 pool。同樣，在小鼠胚胎干細(xì)胞中，即使在距離關(guān)鍵多能性基因（如Nanog和Pou5f1）調(diào)控區(qū)1至20千堿基的位點(diǎn)進(jìn)行編輯，也觀察到了干性標(biāo)志物SSEA-1陽(yáng)性細(xì)胞比例的顯著下降，細(xì)胞發(fā)生 premature 分化。進(jìn)一步的檢測(cè)排除了大片段缺失或染色體重排等突變因素，表明細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變主要源于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的非突變性改變。

為了揭示其背后的機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入的分子分析。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPR編輯后，DNA雙鏈斷裂處會(huì)啟動(dòng)一種稱為“DNA切除”的修復(fù)過(guò)程，產(chǎn)生長(zhǎng)單鏈DNA。這種單鏈DNA的形成會(huì)取代原本結(jié)合在雙鏈DNA上的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白CTCF。CTCF是維持染色質(zhì)三維構(gòu)象的重要因子，其被取代直接導(dǎo)致了染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了ACC-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)編輯同樣破壞了依賴“ condensate”形成的遠(yuǎn)距離調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。綜合這些變化，原本由三維空間鄰近的基因調(diào)控關(guān)系被重新“布線”，導(dǎo)致遠(yuǎn)距離基因的表達(dá)發(fā)生紊亂，最終觸發(fā)了干細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變。

最后，為了減少基因編輯帶來(lái)的這些非預(yù)期影響，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了多種優(yōu)化策略。他們發(fā)現(xiàn)，使用不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的堿基編輯器，可以有效避免染色質(zhì)的開(kāi)放和干性的喪失。此外，通過(guò)對(duì)sgRNA的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，使其遠(yuǎn)離調(diào)控元件富集區(qū)域，也能降低擾動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)。更重要的是，通過(guò)藥物（如Mirin）短暫抑制DNA切除過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白MRN復(fù)合物，可以顯著縮短單鏈DNA的延伸范圍，減輕染色質(zhì)擾動(dòng)，并保護(hù)干細(xì)胞 identity，同時(shí)不影響編輯效率。這些發(fā)現(xiàn)為未來(lái)開(kāi)發(fā)更安全的基因編輯工具和策略提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)踐方向。

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