蛋白質(zhì)與DNA的相互作用是DNA復制、轉(zhuǎn)錄、重組與修復等關(guān)鍵核內(nèi)生命過程得以實現(xiàn)的分子基礎(chǔ)。針對蛋白質(zhì)–DNA相互作用的傳統(tǒng)研究方法存在局限性。體外實驗如electrophoretic mobility shift assay (EMSA)作為檢測蛋白質(zhì)–DNA互作的常規(guī)方法，操作簡便、快速高效，但多采用體外重組蛋白，難以完整保留蛋白質(zhì)天然的翻譯后修飾與空間結(jié)構(gòu)；而體內(nèi)實驗如chromatin immunoprecipitation (ChIP)雖能還原細胞內(nèi)蛋白質(zhì)真實生理狀態(tài)，但耗時長、步驟復雜、對抗體與實驗條件要求嚴格。因此，亟需發(fā)展兼具操作簡便與保留蛋白質(zhì)天然狀態(tài)的檢測方法。

近日，Journal of Genetics and Genomics在線發(fā)表東北林業(yè)大學/沈陽農(nóng)業(yè)大學王玉成教授團隊題為“Plant-based native electrophoretic shift immunoassay (PN-ESI) enables semi-in-vivo detection of native protein-DNA interactions”的研究論文。該研究開發(fā)的基于植物的非變性凝膠遷移免疫分析技術(shù)(PN?ESI)，兼具保留植物體內(nèi)蛋白質(zhì)真實生理狀態(tài)與體外生化檢測操作簡便、流程高效的雙重優(yōu)勢，在近生理狀態(tài)下實現(xiàn)了蛋白質(zhì)–DNA相互作用的精準、高效檢測。

該研究首先在植物體內(nèi)瞬時表達帶標簽的目標蛋白，提取含目標蛋白的細胞核提取物后，與無標記的目標DNA片段進行體外結(jié)合反應，再經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過免疫印跡完成蛋白質(zhì)–DNA復合物的特異性檢測。在總核蛋白用量、DNA探針及其用量相同的條件下，PN-ESI的檢測靈敏度較傳統(tǒng)EMSA提升至少10倍，且檢測結(jié)果與ChIP相互印證。隨后，利用PN-ESI進一步檢測了預測的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子PdbSCL1和BpTCP20)與DNA的相互作用，同時進行了EMSA驗證。鑒于PN-ESI直接采用細胞核內(nèi)的天然功能狀態(tài)的蛋白質(zhì)，可最大程度保留磷酸化、乙酰化等關(guān)鍵翻譯后修飾狀態(tài)，為解析翻譯后修飾對蛋白質(zhì)–DNA相互作用的調(diào)控效應提供了可靠技術(shù)支撐。

基于植物的非變性凝膠遷移免疫分析技術(shù)(PN-ESI)流程及檢測應用

綜上所述，該研究建立了一套快速、靈敏、可忠實反映蛋白質(zhì)天然功能狀態(tài)的半體內(nèi)檢測技術(shù)體系PN-ESI。該技術(shù)與EMSA和ChIP互為補充，可在近生理條件下解析蛋白質(zhì)–DNA相互作用。

作者簡介

東北林業(yè)大學林木遺傳育種全國重點實驗室博士后王鵬宇為該論文第一作者，東北林業(yè)大學/沈陽農(nóng)業(yè)大學王玉成教授為通訊作者。相關(guān)工作得到國家自然科學基金資助。