精液來源外泌體開辟眼底病無創(chuàng)治療新范式

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）作為兒童最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，因其位于視網(wǎng)膜的特殊位置以及眼組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)，長期以來面臨嚴(yán)峻的治療挑戰(zhàn)。目前的治療手段，如玻璃體內(nèi)注射、放療、冷凍療法和全身化療，常導(dǎo)致嚴(yán)重的眼部結(jié)構(gòu)損傷和全身毒性反應(yīng)，而對于存在眼外擴散風(fēng)險的患者，眼球摘除術(shù)仍是無奈之選，這意味著永久性的視力喪失。這些局限性凸顯了開發(fā)既能有效將藥物遞送至眼后段，又能最大程度減少副作用的無創(chuàng)、靶向治療的迫切需求。眼后段受到血-視網(wǎng)膜屏障和角膜上皮等多重生物屏障的保護，嚴(yán)重限制了治療藥物的滲透，使得無創(chuàng)給藥成為眼科領(lǐng)域的一大難題。

沈陽藥科大學(xué)張宇教授團隊利用精液來源的外泌體（SEVs）作為藥物載體，實現(xiàn)無創(chuàng)的眼底遞送。研究發(fā)現(xiàn)，SEVs 憑借其表皮生長因子（EGF）的表達(dá)，能夠可逆地打開眼組織屏障的緊密連接，通過角膜和結(jié)膜雙重途徑高效到達(dá)眼后段。基于這一發(fā)現(xiàn)，研究團隊構(gòu)建了 FA-SEVs@CMG 滴眼液，將葉酸（FA）修飾的 SEVs 與一種由碳點（CDs）、二氧化錳（MnO?）和葡萄糖氧化酶（Gox）組成的納米酶系統(tǒng)（CMG）相結(jié)合。該滴眼液利用 SEVs 優(yōu)異的穿透能力和 FA 的靶向作用，將藥物高效遞送至視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞。內(nèi)化后的 CMG 系統(tǒng)誘導(dǎo)強烈的氧化應(yīng)激，破壞自噬-凋亡平衡，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的自我毀滅。在體內(nèi)實驗中，F(xiàn)A-SEVs@CMG 有效抑制了 RB 的生長，同時保留了視網(wǎng)膜功能，為眼后段疾病的治療提供了一種變革性的策略。相關(guān)論文以“Harnessing semen-derived exosomes for noninvasive fundus drug delivery: A paradigm for exosome-based ocular fundus therapeutics”為題，發(fā)表在Science Advances上，并被Nature作為研究亮點報道。

研究團隊首先合成了具有雙重功能的碳點（CDs）。通過一步溶劑熱法，以檸檬酸、硫脲、氯化亞鐵和硼酸為前驅(qū)體，制備出的 CDs 粒徑均一（約4.14 nm），展現(xiàn)出優(yōu)異的近紅外熒光特性，發(fā)射峰位于621 nm，且光穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)成像劑，這為后續(xù)實時追蹤藥物在眼內(nèi)的分布奠定了基礎(chǔ)。同時，通過高分辨透射電鏡、元素映射和X射線光電子能譜等表征手段，研究人員確認(rèn)了 CDs 中 Fe-N?S-B/C 配位中心的原子結(jié)構(gòu)，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了 CDs 卓越的過氧化物酶（POD）樣活性，能夠在腫瘤微環(huán)境中高效催化產(chǎn)生活性氧（圖2）。

圖1. FA-SEVs@CMG 在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療中的作用機制示意圖。 SEVs 能夠暫時性破壞眼屏障的緊密連接，促進 CMG 向眼后段的遞送。在腫瘤微環(huán)境中，CMG 產(chǎn)生強烈的氧化應(yīng)激，擾亂自噬-凋亡的平衡，促使自噬從細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的守護者轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞死亡的放大器，并通過激活外源性凋亡通路（BID-caspase-8）進一步促進凋亡，從而誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自我毀滅。

在確認(rèn)了 CDs 的性能后，研究者從豬精液中成功提取并表征了 SEVs。透射電鏡圖像顯示了 SEVs 經(jīng)典的囊泡形態(tài)，動態(tài)光散射和納米顆粒追蹤分析證實其粒徑約為120 nm，且具有良好的單分散性。Western blot 分析確認(rèn)了 SEVs 表達(dá)典型的外泌體標(biāo)志物（CD9、CD63、Alix），而幾乎不含有細(xì)胞器污染，證明了分離產(chǎn)物的高純度（圖2）。

圖2. CDs 的合成與 SEVs 的提取。 （A）CDs 合成方法的示意圖。（B）CDs 的透射電鏡和高分辨透射電鏡圖像；插圖為計算的平均粒徑（納米）。（C）透射電鏡能譜圖譜估算的元素原子含量。（D）SEVs 收集與分離流程示意圖。（E）SEVs 的透射電鏡圖像。（F）動態(tài)光散射（DLS）和（G）納米顆粒追蹤分析（NTA）測定的 SEVs 粒徑（n=3）。（H）免疫印跡分析 SEVs 及上清液+精子細(xì)胞中表達(dá)的外泌體標(biāo)志物（CD9、CD63 和 Alix）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物（鈣連蛋白）、線粒體標(biāo)志物（COX IV）和細(xì)胞核標(biāo)志物（組蛋白 H3）。

為驗證 SEVs 的滲透能力，研究者將 CDs 裝載入 SEVs（SEVs-CDs）并進行了體外角膜滲透實驗。Franz 擴散池結(jié)果顯示，SEVs-CDs 在10小時內(nèi)的角膜累積滲透率高達(dá)14.0%，顯著優(yōu)于魚精蛋白修飾的脂質(zhì)體、腫瘤細(xì)胞來源外泌體以及游離 CDs。在離體角膜上皮細(xì)胞單層模型中，SEVs-CDs 的表觀滲透系數(shù)（Papp）同樣最高。更重要的是，在小鼠和兔眼組織切片中，SEVs-CDs 在滴眼后6小時迅速在視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜區(qū)域富集，而游離 CDs 幾乎未見明顯信號。這些結(jié)果直觀地證明了 SEVs 作為無創(chuàng)眼底遞送載體的巨大潛力（圖3，圖4A-E）。

圖3. SEVs 眼內(nèi)滲透能力的研究。 （A）CDs、ProLs-CDs、SEVs-CDs 和 Y79Es-CDs 的粒徑和 zeta 電位分布。（B）以兔角膜為膜的 Franz 透皮擴散示意圖。（C）不同組別的體外兔角膜累積滲透百分比。（D）在指定時間點局部給予不同眼用制劑后，CDs 在小鼠眼組織和視網(wǎng)膜組織中分布的熒光共聚焦顯微鏡圖像，以及（E）圖像量化分析[4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）：藍(lán)色，CDs：紅色]。h，小時；a.u.，任意單位。（F）使用不同滴眼液后，CDs 在小鼠整個眼球中的穿透情況。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖（B）、（C）和（E）中的 P 值通過單因素方差分析（ANOVA）與 Tukey 事后檢驗計算（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。

進一步的機制研究表明，SEVs 之所以能高效滲透眼組織，關(guān)鍵在于其能夠可逆地調(diào)控細(xì)胞間的緊密連接。免疫熒光染色顯示，SEVs 處理會導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞中 ZO-1、F-肌動蛋白、閉合蛋白和E-鈣粘蛋白的表達(dá)降低，但與魚精蛋白不同的是，SEVs 處理后的緊密連接蛋白在24小時內(nèi)可恢復(fù)至正常水平?？缟掀る娮瑁═EER）監(jiān)測結(jié)果也證實，SEVs 在1小時內(nèi)引起約45%的可逆性電阻下降，而魚精蛋白則導(dǎo)致27%的不可逆損失。這種可逆的、非破壞性的緊密連接重塑機制，使得 SEVs 在確保高效遞送的同時，也保障了眼組織屏障的長期完整性（圖4F-H）。

圖4. SEVs 眼內(nèi)滲透性的體內(nèi)驗證及機制研究。 （A）不同滴眼液處理后不同時間點收集的兔眼球共聚焦圖像（DAPI：藍(lán)色，CDs：紅色）。應(yīng)用 SEVs-CDs 滴眼液后1小時（B）、6小時（C）、12小時（D）和24小時（E）兔眼角膜、虹膜、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜、晶狀體、玻璃體和房水中 CDs 的分布。（F）不同處理條件下 ZO-1 分布的免疫熒光成像和定量分析。（G）不同處理組孵育后人角膜上皮細(xì)胞（HCEC）單層中（Ga）E-鈣粘蛋白和（Gb）閉合蛋白的 Western blot 分析。Western blot 條帶強度使用 ImageJ 量化，并歸一化至相應(yīng)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）水平。（H）暴露1小時及磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，在23小時內(nèi)監(jiān)測不同處理組 HCEC 的跨上皮電阻（TEER）。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。圖（F）、（Ga）、（Gb）和（H）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。

通過對不同品種豬來源的 SEVs 進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，研究者發(fā)現(xiàn) SEVs 的EGF表達(dá)水平與眼內(nèi)滲透能力呈強正相關(guān)。利用 EGF 中和抗體處理 SEVs 后，其誘導(dǎo)緊密連接開放和促進眼內(nèi)滲透的能力顯著下降。進一步的信號通路研究證實，SEVs 通過其表面的 EGF 蛋白激活角膜上皮細(xì)胞上的表皮生長因子受體（EGFR），進而引發(fā) Src 蛋白激酶磷酸化、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，從而可逆地開放緊密連接。使用 EGFR、Src 或 MLCK 的特異性抑制劑，均可阻斷 SEVs 的滲透增強效應(yīng)（圖5，圖6）。這一系列實驗首次揭示了 SEVs 介導(dǎo)眼屏障通透性的關(guān)鍵分子機制，為仿生納米載體的設(shè)計提供了全新靶點。

圖5. SEVs 的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及介導(dǎo)眼屏障穿透蛋白的篩選。 （A）樣本相關(guān)性熱圖。（B）A至E組中 CD9、CD63 和 Alix 的表達(dá)水平。給藥后6小時，A至E組 SEVs 滲透進入小鼠（C）和兔（D）眼睛的情況。E 組與 B 組（E）以及 D 組與 C 組（F）差異表達(dá)蛋白的火山圖。（G）SEVs 中促進精子穿透生殖屏障的蛋白（如 PTGDS 和 ACRV1），以及與眼屏障緊密連接調(diào)控通路相關(guān)的蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選和定量分析。（H）蛋白表達(dá)譜與眼內(nèi)滲透性指標(biāo)間相關(guān)分析的熱圖可視化。

圖6. EGF 影響 SEVs 眼內(nèi)滲透性的機制。 （A）通過抗 EGF 抗體抑制 SEVs 相關(guān) EGF 的 Western blot 驗證。EGF 抗體抑制前后 SEVs 在小鼠（B）和兔（C）眼中的滲透效率。（D）EGF 抗體抑制前后 SEVs 對 HCEC 單層 TEER 的影響。（E）Western blot 分析 EGF、SEVs 或抗 EGF SEVs 處理的 HCEC 單層中 EGFR-Src-MLCK-MLC 通路的激活情況。與 EGFR/Src/MLCK 抑制劑（吉非替尼、達(dá)沙替尼和 ML-7）共處理的 HCEC 單層中，EGF（F）/SEVs（G）對 TEER 的調(diào)節(jié)作用。與 EGFR/Src/MLCK 抑制劑共處理的 HCEC 單層中，EGF（H）/SEVs（I）對 MLC 磷酸化的誘導(dǎo)作用。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。圖（B）和（C）中的 P 值通過配對 t 檢驗計算（P < 0.0001）。圖（D）、（F）和（G）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（P < 0.05，P < 0.01，**P < 0.001，****P < 0.0001）（n = 3）。

在確證了 SEVs 的遞送效率后，研究團隊構(gòu)建了針對 RB 的治療體系 FA-SEVs@CMG。通過將裝載有 CMG 納米酶系統(tǒng)的 SEVs 表面修飾葉酸，實現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的主動靶向。透射電鏡和動態(tài)光散射等表征手段確認(rèn)了該復(fù)合納米系統(tǒng)的成功構(gòu)建，其粒徑約為142 nm，且保留了 SEVs 原有的滲透能力（圖8）。體外細(xì)胞實驗顯示，F(xiàn)A-SEVs@CMG 能夠通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲作用高效進入 Y79 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并定位于溶酶體酸性環(huán)境中，激活其酶活性（圖8）。

圖7. CDs 的原子結(jié)構(gòu)表征。 （A）CDs 中 Fe K 邊的 XANES 譜。（B）CDs、FeS?、Fe 箔、FePc、Fe?O? 和 FeO 的 EXAFS 譜的傅里葉變換 k2 加權(quán) χ(k) 函數(shù)。（C）CDs 和參考樣品（Fe 箔、FeS?、FeO、Fe?O? 和 FePc）的 k3 加權(quán) EXAFS 數(shù)據(jù)的小波變換等高線圖。（D）CDs、Fe 箔、FeS?、FeO、Fe?O? 和 FePc 的 FT k2 加權(quán) EXAFS 譜。（E）CDs 在 R 空間的相應(yīng) EXAFS 擬合曲線。插圖：CDs 表面模型。（F）CDs 在 k 空間的 EXAFS 擬合曲線。

圖8. FA-SEVs@CMG 的制備及細(xì)胞內(nèi)抗癌治療。 （A）FA-SEVs@CMG 在環(huán)境光（左）和 350 nm 激光照射（右）下的外觀。（B）MnO?、CMG 和 FA-SEVs@CMG 的透射電鏡圖像。（C）不同材料的動態(tài)光散射（DLS）粒徑和（D）zeta 電位。（E）SEVs、SEVs@CMG 和 FA-SEVs@CMG 的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白分析。（F）游離 CDs、CMG、SEVs@CMG 和 FA-SEVs@CMG 在 Y79 細(xì)胞中孵育 1 小時和 4 小時的共聚焦熒光成像。各組 CDs 的熒光定量結(jié)果如右圖所示。細(xì)胞核用 DAPI（藍(lán)色）染色，溶酶體用 LysoTracker Green 染色。（G）溫度和內(nèi)吞抑制劑對不同組別在 Y79 細(xì)胞中細(xì)胞攝取的影響。以不同組別的非抑制內(nèi)吞作用作為陽性對照。（H）通過 2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）對 Y79 細(xì)胞中活性氧（ROS）進行共聚焦熒光成像。各組 ROS 熒光強度的定量結(jié)果如右圖所示。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖（F）中的 P 值通過配對 t 檢驗計算（*P < 0.001，**P < 0.0001）。圖（G）和（H）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（****P < 0.0001）（n = 3）。

在抗腫瘤機制方面，F(xiàn)A-SEVs@CMG 展現(xiàn)了三重殺傷效應(yīng)。進入細(xì)胞后，CMG 系統(tǒng)在腫瘤微環(huán)境條件下發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)：MnO? 消耗谷胱甘肽（GSH）并產(chǎn)生氧氣，氧氣進一步促進葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫又在 CDs 的過氧化物酶活性催化下生成大量羥基自由基（·OH），引發(fā)劇烈的氧化應(yīng)激。這種氧化應(yīng)激不僅誘導(dǎo)了鐵死亡（表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化物累積和 GPX4 下調(diào)），還導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰，激活了內(nèi)在凋亡通路（caspase-9/-3/-7 活化）。更重要的是，過度的氧化應(yīng)激將自噬從保護機制轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎佬盘枺鹤允刹粌H無法挽救細(xì)胞，反而通過激活 BID-caspase-8 軸啟動了外源性凋亡通路，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自我毀滅（圖9）。通過使用自噬抑制劑 3-MA 和活性氧清除劑 NAC，研究者進一步證實了這種應(yīng)激強度依賴性的自噬-凋亡轉(zhuǎn)換機制。

圖9. FA-SEVs@CMG 的抗癌機制研究。 （A）不同處理組 Y79 細(xì)胞中 LC3/II、GPX4 和 Caspase-9 蛋白的 Western blot 結(jié)果。（B）有無 3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理時，Y79 細(xì)胞中 Caspase-3 和（C）Caspase-7 蛋白活性。（D）不同處理組 Annexin V/PI 染色的 Y79 細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。（E）3-MA 處理下，不同處理組 Annexin V/PI 染色的 Y79 細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。（F）有無 3-MA 處理時，不同處理組 Y79 細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù) Annexin V/PI 染色的定量結(jié)果。有無 3-MA 處理時，不同處理組 Y79 細(xì)胞中 Caspase-9、Bcl-2、Caspase-9 和 BID 蛋白的 Western blot 結(jié)果（G）無 3-MA，（H）有 3-MA。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。圖（B）、（C）和（F）中的 P 值通過配對 t 檢驗計算（*P < 0.05 和 **P < 0.0001）（n = 3）。

在動物實驗中，研究團隊建立了原位 RB 小鼠模型。結(jié)果顯示，F(xiàn)A-SEVs@CMG 滴眼液治療組的小鼠眼內(nèi)生物發(fā)光信號顯著減弱，腫瘤面積僅相當(dāng)于對照組的2.35%，而游離 CDs 組和 CMG 組的腫瘤負(fù)擔(dān)依然很高。組織切片染色進一步證實了 FA-SEVs@CMG 的卓越抗腫瘤效果，同時，視網(wǎng)膜電圖（ERG）檢測顯示，接受 FA-SEVs@CMG 治療的小鼠保留了近乎正常的視網(wǎng)膜功能（圖10）。熒光成像結(jié)果還顯示，F(xiàn)A-SEVs@CMG 能夠?qū)崟r監(jiān)測腫瘤大小，體現(xiàn)了其診療一體化的潛力。在安全性評估方面，研究者對 SEVs 來源進行了嚴(yán)格的病毒檢測，證實其安全性。長期給藥后的組織病理學(xué)檢查、眼壓監(jiān)測和免疫反應(yīng)分析均未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用或眼內(nèi)免疫激活，證實了該制劑具有良好的生物相容性（圖10）。

圖10. FA-SEVs@CMG 在 RB 小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究。 （A）建立 RB 模型及動物實驗設(shè)計的示意圖。（B）30天內(nèi)不同處理后 Y79 RB 小鼠的代表性體內(nèi)生物發(fā)光圖像及平均生物發(fā)光信號定量結(jié)果（Ba）。（C）不同處理30天后，小鼠眼睛的代表性圖像和（D）蘇木精-伊紅（H&E）染色切片。（Da）圖（D）中腫瘤面積的定量結(jié)果。（E）不同處理后 RB 小鼠在暗適應(yīng)條件下的代表性視網(wǎng)膜電圖（ERG）波形響應(yīng)。虛線表示陽性對照組的 a 波和 b 波值。（F）不同處理后 RB 組織中 P62、TUNEL 和 Ki-67 的代表性免疫熒光結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。圖（Ba）和（Da）中的 P 值通過單因素方差分析與 Tukey 事后檢驗計算（n = 3）（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001）。

總而言之，這項研究首次建立了基于精液來源外泌體的無創(chuàng)眼后段遞送平臺，成功解決了外泌體藥物在眼部無創(chuàng)遞送領(lǐng)域的核心瓶頸。通過揭示 SEVs 依賴 EGF-EGFR 信號軸可逆調(diào)控緊密連接的機制，研究不僅為眼底病治療提供了新的載體選擇，更為開發(fā)仿生納米載體指明了方向。FA-SEVs@CMG 滴眼液集高效穿透、主動靶向、多重殺傷和實時監(jiān)測于一體，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤模型中取得了顯著的治療效果，同時保留了寶貴的視力。這一突破性成果不僅為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的患兒帶來了新的希望，也為年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變等其他眼后段疾病的治療提供了具有廣闊應(yīng)用前景的通用策略。盡管臨床轉(zhuǎn)化仍面臨規(guī)?；a(chǎn)、標(biāo)準(zhǔn)化和免疫原性等挑戰(zhàn)，但該研究無疑為眼后段疾病的治療范式帶來了深刻的變革。