DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是最重要的表觀遺傳修飾之一，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用；而DNA去甲基化對于維持全基因組適當?shù)腄NA甲基化水平至關重要。ROS1作為首個被報導的DNA去甲基化酶，其去甲基化機制與生物學功能一直是該領域的核心科學問題。然而，目前仍存在以下關鍵未解難題：1）由于ROS1蛋白DNA結合能力較弱，其全基因組結合圖譜與特征至今未知，極大限制了對其功能的全面理解；2）傳統(tǒng)觀點認為ROS1去甲基化的主導模式為主動模式，但該范式存在悖論——廣泛且頻繁的堿基切除修復嚴重威脅基因組穩(wěn)定性；3）ROS1是否具有DNA去甲基化之外的功能仍有待闡明。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學油菜團隊趙倫教授聯(lián)合南方科技大學朱健康院士在Nature Plants發(fā)表題為“Occupancy-basedmechanismis thechiefmode of ROS1function inpreventing DNAhypermethylation”的研究論文。該研究以甘藍型油菜和擬南芥為對象，澄清了ROS1去甲基化機制的關鍵爭議，并解決了其與基因組穩(wěn)定性的長期悖論；首次繪制了ROS1高質(zhì)量全基因組結合圖譜，揭示ROS1作為染色質(zhì)可及性關鍵標志與調(diào)控者的新功能；并進一步闡明了上述兩種功能之間的相關性與獨立性，從而重塑DNA去甲基化酶的功能認知框架。

ROS1調(diào)控擬南芥與油菜氣孔發(fā)育

ROS1在油菜氣孔發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控功能。在甘藍型油菜中，ROS1有兩個同源拷貝，功能冗余。利用CRISPR/Cas9構建的bnaros1突變體表現(xiàn)為氣孔數(shù)目顯著增多且氣孔附近小細胞簇增多等表型。與之相比，擬南芥ros1-4突變體主要表現(xiàn)為小細胞簇增多(Yamamuro et al., Nature Communications. 2014)，表明ROS1在油菜中可能存在功能分化。

圖1. 甘藍型油菜bnaros1單突變體和雙突變體的氣孔發(fā)育表型

首次繪制ROS1高質(zhì)量全基因組結合圖譜，揭示其為可及性染色質(zhì)標記

精準鑒定ROS1全基因組結合位點對于全面理解其功能至關重要。盡管ChIP-seq被認為是鑒定全基因組組蛋白修飾和染色質(zhì)相關蛋白結合位點的金標準，ROS1因DNA結合能力弱，其全基因組結合位點與特征至今未知。為應對這一挑戰(zhàn)，該團隊前期開發(fā)了高效、靈敏、普適于植物經(jīng)濟器官與低豐度染色質(zhì)相關蛋白的新技術aChIP（Zhang, et al., Nature Plants. 2024; 中國發(fā)明專利：CN117431294B）。鑒于在該領域取得的進展，近期受邀在《中國科學：生命科學》撰寫綜述《植物ChIP-seq技術的革新與應用》，系統(tǒng)總結技術進展，提出數(shù)據(jù)質(zhì)量評價標準，并展望其在基因調(diào)控網(wǎng)絡解析與作物遺傳改良中的應用前景。

本研究利用aChIP技術在擬南芥和油菜中首次繪制了高質(zhì)量的ROS1全基因組結合圖譜。整合表觀基因組分析表明，ROS1結合位點并非隨機分布，而與可及性染色質(zhì)高度共定位；且在不同組織及基因型（如hda6）中，這一共定位模式保持穩(wěn)定。據(jù)此，研究人員首次提出ROS1可作為可及性染色質(zhì)的重要標記。支持這一觀點的是，ROS1在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出非特異性DNA結合特性，這與其廣泛分布于可及性染色質(zhì)區(qū)域以及缺乏典型序列特異性DNA結合結構域的特點一致。因此，ROS1可能并非像轉(zhuǎn)錄因子那樣通過特異性序列識別招募至基因組，這一發(fā)現(xiàn)拓展了ROS1與染色質(zhì)相互作用的認知框架。

圖2. ROS1全基因結合位點（占位）與可及性染色質(zhì)共定位。

N與C端結構域驅(qū)動ROS1家族蛋白差異性靶向可及性染色質(zhì)

通過一系列結構域截短實驗證實，ROS1對可及性染色質(zhì)的特異性結合不依賴CXXC結構域，而主要由N端（富含賴氨酸）與C端（含RRM）結構域介導，缺失任一結構域均會改變其結合模式。由于油菜兩個ROS1同源蛋白的N端高度保守，其結合模式保持一致；相比之下，ROS1家族的其他成員（DME、DML2、DML3）由于N端結構存在較大差異，其結合模式類似截短的ROS1，并偏向H3K4me3等特定活躍位點。這些結果表明，N端與C端結構域的差異是ROS1家族蛋白靶向分化的核心機制。

圖3. N端與C端結構域?qū)τ赗OS1特異性靶向可及性染色質(zhì)至關重要

ROS1僅直接調(diào)控約四分之一的DNA甲基化差異位點

先前普遍認為ROS1直接調(diào)控所有DNA甲基化差異位點（ros1-4 vs Col-0 hyper-DMR）。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)ROS1結合位點（Type I，約94%）在ros1-4突變體中仍保持低甲基化狀態(tài)，表明這些位點不受ROS1調(diào)控；ROS1僅直接結合并調(diào)控約25%的甲基化差異位點（Type II），其余約75%位點（Type III）缺乏明顯ROS1結合信號，應為間接調(diào)控。這些結果重塑了對ROS1調(diào)控功能及作用方式的認知：它僅直接調(diào)控少部分DNA甲基化差異位點，但可能在調(diào)控染色質(zhì)可及性中發(fā)揮廣泛作用。

圖4. ROS1僅直接調(diào)控約四分之一的DNA甲基化差異位點

ROS1占位機制阻止RdDM招募，維持DNA低/無甲基化狀態(tài)

先前研究表明，ROS1拮抗RdDM（RNA-directed DNA methylation）維持基因組低/無甲基化狀態(tài)，但其分子機制尚不清楚。為此，本研究提出兩種假設：1）ROS1與RdDM同時靶向相同位點，一邊建立DNA甲基化一邊去除甲基化；2）ROS1通過占位阻止RdDM招募從而抑制DNA甲基化建立，使得RdDM僅在ROS1缺失時發(fā)揮作用。

本研究通過整合ROS1與NRPD1的全基因組結合圖譜及相關突變體的DNA甲基化數(shù)據(jù)，將RdDM相關位點劃分為兩類：I型位點為非ROS1靶位點，RdDM正常建立DNA甲基化；II型位點為拮抗位點，在野生型中幾乎沒有RdDM招募和DNA甲基化沉積，而在ROS1缺失后則被RdDM占據(jù)并建立甲基化。本研究結果支持“占位拮抗”模型（假設2），即ROS1通過占據(jù)靶位點阻止RdDM招募，從而維持基因組低/無甲基化狀態(tài)。該機制不僅揭示了ROS1拮抗RdDM維持DNA低/無甲基化狀態(tài)的分子基礎，也避免了全基因組頻繁堿基切除對基因組穩(wěn)定性造成的巨大風險。

圖5. ROS1通過占位機制拮抗RdDM，維持DNA低/無甲基化狀態(tài)

ROS1去甲基化主導模式為“被動”，而非“主動”

DNA去甲基化對維持基因組正常甲基化水平至關重要，主要包括被動去甲基化和主動去甲基化兩種方式。被動去甲基化是指細胞復制過程中，甲基轉(zhuǎn)移酶不再維持甲基化，導致甲基化逐代“稀釋”；主動去甲基化則依賴DNA去甲基化酶直接切除甲基化堿基5mC并修復DNA。過去二十多年，傳統(tǒng)觀點認為ROS1主要通過糖苷酶/裂解酶活性直接去除5-甲基胞嘧啶（5mC），啟動堿基切除修完成主動去甲基化。然而，這一經(jīng)典模型存在諸多爭議：其一，ROS1切除甲基化堿基的證據(jù)主要來自體外實驗，難以完全反映植物體內(nèi)真實情況；其二，ROS1缺失后基因組出現(xiàn)廣泛高甲基化，表明其確實參與去甲基化，但具體機制尚不明確；其三，該模型無法解釋一個矛盾——若全基因組范圍內(nèi)頻繁發(fā)生大規(guī)模堿基切除，基因組穩(wěn)定性如何維持？

本研究通過體內(nèi)實驗證實，ROS1去甲基化的主導模式為被動去甲基化。將971位天冬氨酸替換為丙氨酸，獲得糖苷酶/裂解酶缺陷型ROS1變體ROS1D971A，該突變體完全喪失5mC酶切活性。然而，ROS1D971A的全基因組占位模式與野生型一致，依然特異性靶向可及性染色質(zhì)區(qū)域，表明其結合模式獨立于酶切活性。將ROS1D971A導入ros1-4突變體后，至少65%的位點DNA甲基化顯著降低。與此一致，ROS1D971A knock-in原位定點氨基酸替換材料中超過90%的位點顯示同樣的趨勢。這些結果表明，ROS1主要依賴占位機制而非酶切活性實現(xiàn)廣泛被動去甲基化，顛覆了長期以來“主動去甲基化主導”的傳統(tǒng)認知，并同時避免了全基因組頻繁切除堿基帶來的基因組穩(wěn)定性風險。

圖6. ROS1去甲基化模式主要依賴占位機制的被動模式。

ROS1通過“現(xiàn)役—預備役”雙重策略保護可及性染色質(zhì)

鑒于ROS1廣泛占據(jù)開放染色質(zhì)區(qū)域，本研究解析了其調(diào)控染色質(zhì)可及性的新功能，并提出其通過“現(xiàn)役—預備役”雙重策略發(fā)揮作用。當某位點是DNA甲基化系統(tǒng)靶位點且該甲基化系統(tǒng)活躍時，ROS1采取“現(xiàn)役”策略：既可獨立維持少量可及性位點，也可與其他表觀調(diào)控因子（如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5等）合作維持染色質(zhì)可及性。相反，當該類位點暫時缺乏DNA甲基化系統(tǒng)作用時，ROS1采用“預備役”策略：一旦DNA甲基化系統(tǒng)重新建立或引入，ROS1則迅速轉(zhuǎn)為“現(xiàn)役”狀態(tài)發(fā)揮保護作用。由此，ROS1通過“現(xiàn)役—預備役”雙重策略，實現(xiàn)對所有可及性染色質(zhì)區(qū)域的動態(tài)保護。

圖7. ROS1“現(xiàn)役”策略：獨自或與GCN5等表觀遺傳調(diào)控因子合作保護可及性染色質(zhì)。

圖8. ROS1“預備役”策略保護可及性染色質(zhì)

ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性可依賴亦可獨立于DNA甲基化

以往研究表明，DNA甲基化與染色質(zhì)可及性通常存在拮抗關系。本研究表明ROS1同時具備DNA去甲基化和染色質(zhì)可及性調(diào)控功能，但二者關系尚不明確。本研究通過分析ros1-4突變體及不同組織的DNA甲基化與染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：在部分位點，ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性依賴DNA甲基化的拮抗作用；而在另一部分位點，尤其是在不同組織間，ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性時不依賴DNA甲基化。由此可見，ROS1的兩種功能既相互關聯(lián)又相對獨立，拓展了對DNA甲基化與染色質(zhì)可及性關系的認知框架。

圖9. ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性可依賴亦可獨立于DNA甲基化

綜上所述，本研究為植物表觀遺傳研究提供了重要數(shù)據(jù)資源，系統(tǒng)重塑了ROS1去甲基化模式認知框架，揭示了ROS1調(diào)控染色質(zhì)可及性的新功能與雙重調(diào)控策略，并進一步解析了這兩種功能之間復雜關系，從機制層面深化了對表觀遺傳調(diào)控體系的理解，為相關機制研究與功能解析提供了新思路與新策略。

華中農(nóng)業(yè)大學鄧利副教授和博士研究生朱光楓、鐘文瑩、賈志博為論文共同第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學趙倫教授和南方科技大學朱健康院士為通訊作者。華中農(nóng)業(yè)大學傅廷棟院士、沈金雄教授、李國亮教授、周強偉副研究員、章清博士、司志鑫、張敏燕，深圳大學杜璇教授、中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心毛妍斐研究員、揚州大學吳健副教授、南方科技大學梁亞峰博士等給予了重要支持。該研究得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中國博士后科學基金等資助。

通訊作者簡介：趙倫，華中農(nóng)業(yè)大學教授、博士生導師，作物遺傳改良全國重點實驗室、國家油菜工程技術研究中心、湖北洪山實驗室固定研究人員，獲國家優(yōu)秀青年科學基金、“武漢英才”優(yōu)秀青年人才等資助，任中國作物學會油料作物專業(yè)委員會委員。主要從事植物表觀/三維基因組學與油菜重要農(nóng)藝性狀研究，以模式植物擬南芥和多倍體模式作物油菜等為對象，綜合運用遺傳學、分子生物學、基因組學、表觀/三維基因組學與生物信息學等手段，解析兩者在多倍體優(yōu)勢及產(chǎn)量性狀形成中的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機制。研究成果以第一或通訊作者（含共同）發(fā)表在Nature Plants (2篇)、Genome Biology (2篇)、Nature Communications (2篇)、Autophagy和Molecular Plant (2篇)等國際主流期刊，為解析油菜等作物重要農(nóng)藝性狀調(diào)控機制及遺傳改良提供了新技術、新視角和新思路。具體研究方向如下：1）植物表觀/三維基因組學技術開發(fā)；2）植物表觀遺傳調(diào)控機制；3）油菜產(chǎn)量性狀調(diào)控機制；4）油菜多倍體雜種優(yōu)勢形成機制。詳情請查看：

https://faculty.hzau.edu.cn/zhaolun/zh_CN/index.htm

Nature Plants論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41477-026-02258-z

《中國科學：生命科學》論文鏈接：

https://www.sciengine.com/SSV/doi/10.1360/SSV-2025-0259