首次在具備血管化和免疫活性的人腦類器官中，實(shí)現(xiàn)了功能性人類小膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)期存活與成熟，這篇 Cell 怎么把類器官研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)做到完美[1]。（原文獻(xiàn)在文末）

根據(jù)研究現(xiàn)狀找「課題方向」

1. 2D 培養(yǎng)失真：脫離大腦環(huán)境的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)進(jìn)入非生理性的激活狀態(tài)，其基因表達(dá)與表觀遺傳特征發(fā)生顯著改變。

2. 類器官缺乏特定細(xì)胞類型： 傳統(tǒng)腦類器官由神經(jīng)外胚層分化而來，可形成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，但小膠質(zhì)細(xì)胞起源于中胚層，因此在標(biāo)準(zhǔn)類器官中天然缺失。

3. 異種移植不匹配：將人源小膠質(zhì)細(xì)胞移植至小鼠大腦后，其所處微環(huán)境為鼠源性，難以真實(shí)反映其與人類神經(jīng)元環(huán)境的相互作用。

總結(jié)：缺一個(gè)既能提供人源微環(huán)境，又能支持小膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)期存活的模型。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

1、體外「播種」—— 讓 EMP 細(xì)胞引入類器官

研究團(tuán)隊(duì)首先利用人 iPSC 分化為 CD43? 紅系-髓系祖細(xì)胞（EMPs）（小膠質(zhì)細(xì)胞的前體），然后將 EMPs 與前腦特異性類器官共培養(yǎng)。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：EMPs 在 12 小時(shí)內(nèi)就能高效侵入類器官，且偏好定居在皮質(zhì)板（CP）樣區(qū)域，避開了腦室區(qū)（VZ）樣區(qū)域 —— 這與人類胚胎發(fā)育中微膠質(zhì)細(xì)胞的徑向遷移模式高度一致。

需要注意的是：體外培養(yǎng)條件下，EMPs 來源的細(xì)胞在約 6 周后開始大量死亡，至 13 周時(shí)存活率降至 5% 以下。存活細(xì)胞形態(tài)趨于圓形，呈現(xiàn)激活狀態(tài)，且不表達(dá)成熟小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。這提示單純體外培養(yǎng)無法支持小膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)期存活（培養(yǎng)基中必須添加 M-CSF、IL-34 和 TGFβ1，否則 EMPs 無法維持）。

2、體內(nèi)「成熟」—— 把類器官移植到小鼠大腦

這是整個(gè)研究的核心創(chuàng)新點(diǎn)！ 研究團(tuán)隊(duì)沒有讓 EMPs-類器官共培養(yǎng)體系在體外硬撐，而是在 EMP 整合后 10 天，將整個(gè)類器官移植到免疫缺陷小鼠（NOD/SCID）的壓后皮質(zhì)。

移植后 8 周，觀察到顯著變化：紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞大量存活，且形態(tài)呈現(xiàn)高度分枝的「靜息態(tài)」，這是健康小膠質(zhì)細(xì)胞的典型特征。更重要的是，這些細(xì)胞開始表達(dá) TMEM119 和 P2RY12，這兩種公認(rèn)的成熟小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物在體外培養(yǎng)細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步顯示，這些小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜與人類胎兒大腦中的真實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞高度一致。隨著移植后時(shí)間延長(zhǎng)（6 周、11 周、24 周），其轉(zhuǎn)錄組特征逐漸趨近于成體小膠質(zhì)細(xì)胞。得出結(jié)論：只有血管化的體內(nèi)環(huán)境，才能支持小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮功能。

3、功能驗(yàn)證 —— 活體成像揭示表型功能

光看形態(tài)和基因還不夠，還得看功能。研究人員用雙光子顯微鏡在活體小鼠中實(shí)時(shí)觀察這些小膠質(zhì)細(xì)胞的行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

• 突觸動(dòng)態(tài)：hMGs 的突觸以約 1.76 μm/min 的速度持續(xù)伸縮，主動(dòng)熟悉周圍環(huán)境。

• 損傷響應(yīng)：在激光誘導(dǎo)的局部損傷后，hMGs 能在 10 分鐘內(nèi)將突觸定向伸向損傷部位。

• 炎癥響應(yīng)：腹腔注射 LPS 后，hMGs 從分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形、大量絲狀偽足的激活狀態(tài)。

這些行為特征跟經(jīng)典的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞研究報(bào)道完全一致，說明這些「人造」 的小膠質(zhì)細(xì)胞功能上也是合格的。

4、疾病模型驗(yàn)證 —— 患者來源細(xì)胞的應(yīng)用

研究者進(jìn)一步利用該模型開展疾病機(jī)制研究。從 3 名伴大頭畸形的自閉癥譜系障礙患者及 3 名正常對(duì)照個(gè)體中分別誘導(dǎo)獲得 iPSC，構(gòu)建個(gè)性化類器官模型。結(jié)果顯示，ASD 患者類器官中的小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)顯著異常：胞體增大、突觸增粗、胞體表面出現(xiàn)大量絲狀偽足，提示細(xì)胞處于激活或應(yīng)激狀態(tài)。

為進(jìn)一步明確異常來源，研究者開展了交叉移植實(shí)驗(yàn)：將正常個(gè)體來源的小膠質(zhì)細(xì)胞移植至 ASD 類器官中，結(jié)果這些正常細(xì)胞同樣表現(xiàn)出異常形態(tài)。反之，將 ASD 患者來源的小膠質(zhì)細(xì)胞移植至正常類器官中，其形態(tài)恢復(fù)正常。該結(jié)果直接證明：ASD 中小膠質(zhì)細(xì)胞的異常并非細(xì)胞內(nèi)在缺陷所致，而是由異常的大腦微環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生。這是首次在活體模型中為「環(huán)境誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)」提供直接證據(jù)。

主要研究結(jié)果

1、模型構(gòu)建 —— 從體外「播種」到體內(nèi)「成熟」

EMP 與前腦類器官共培養(yǎng)后，EMP 在 12 小時(shí)內(nèi)高效整合并定位于皮質(zhì)板樣區(qū)域，與人類胚胎發(fā)育過程一致。體外培養(yǎng)條件下，EMP 來源細(xì)胞存活率逐漸下降，至 13 周低于 5%，且不表達(dá)成熟標(biāo)志物 P2RY12 和 TMEM119。將整合后的類器官移植至免疫缺陷小鼠大腦后，8 周后超過 99% 的細(xì)胞呈現(xiàn)高度分枝的靜息態(tài)形態(tài)，高表達(dá) TMEM119 和 P2RY12，且類器官實(shí)現(xiàn)良好血管化，表明體內(nèi)環(huán)境是小膠質(zhì)細(xì)胞成熟的關(guān)鍵因素。

2、轉(zhuǎn)錄組軌跡 —— 小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育路徑

研究者對(duì)移植后 6 周、11 周、24 周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序（共 4,322 個(gè)細(xì)胞）。結(jié)果顯示，這些小膠質(zhì)細(xì)胞沿著一條與人類胎兒小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育高度一致的軌跡成熟。從 6 周到 24 周，P2RY12、TMEM119、SALL1、CX3CR1 等穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物表達(dá)持續(xù)上調(diào)，并鑒定出一個(gè)增殖性亞群（高表達(dá) MKI67/RRM2），與人類胎兒大腦中的增殖性小膠質(zhì)細(xì)胞亞群高度一致。

3、環(huán)境決定論 —— 人源環(huán)境塑造人源特征

這是整篇文章最核心的機(jī)制發(fā)現(xiàn)。研究者對(duì)比了兩種環(huán)境下的人源小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：一種是人腦類器官（iHBO 模型），另一種是直接移植到小鼠大腦（xMGs 模型）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：人源環(huán)境中，小膠質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)人類/大動(dòng)物特有基因（SLC8A1、VSIG4、IRAK3）；小鼠環(huán)境中，小膠質(zhì)細(xì)胞反而開始表達(dá)小鼠特有基因（LY6E、TPI1）。這直接證明：小膠質(zhì)細(xì)胞的物種特異性特征不是細(xì)胞自身固有的，而是由大腦微環(huán)境所塑造。

4、功能驗(yàn)證與疾病應(yīng)用

功能驗(yàn)證：用雙光子顯微鏡在活體小鼠中實(shí)時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn) hMGs 的突觸以約 1.76 μm/min 的速度持續(xù)「巡邏」，激光損傷后 10 分鐘內(nèi)定向伸向損傷部位，LPS 刺激后從分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形激活態(tài)。這些行為與經(jīng)典小膠質(zhì)細(xì)胞研究完全一致。

疾病應(yīng)用：在 ASD 患者來源模型中，hMGs 出現(xiàn)胞體增大、突觸增厚、大量絲狀偽足等異常。交叉移植實(shí)驗(yàn)證明：正常人源 hMGs 移植到 ASD 類器官中也會(huì)變「壞」，而 ASD 患者 hMGs 移植到正常環(huán)境中則恢復(fù)正常。這直接證明：ASD 中小膠質(zhì)細(xì)胞異常是由異常的大腦環(huán)境誘導(dǎo)的，而非細(xì)胞內(nèi)在缺陷。

小編點(diǎn)評(píng)

這篇 Cell 的研究思路有幾個(gè)特別值得借鑒的地方。

1、體外構(gòu)建與體內(nèi)成熟相結(jié)合的策略

在類器官培養(yǎng)過程中，長(zhǎng)期維持三維結(jié)構(gòu)的活性與功能是常見挑戰(zhàn)。本研究表明，當(dāng)類器官在體外出現(xiàn)中心壞死、細(xì)胞存活率下降等問題時(shí)，可考慮將類器官移植至動(dòng)物體內(nèi)，借助宿主血管系統(tǒng)與微環(huán)境完成后續(xù)的功能成熟。這種「體外構(gòu)建結(jié)構(gòu)、體內(nèi)完成功能成熟」的兩步策略，可推廣至多種類器官模型，如肝臟類器官中免疫細(xì)胞的整合，或腸道類器官中神經(jīng)-免疫互作的研究。

2、交叉移植實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以區(qū)分內(nèi)在與外在因素

在疾病機(jī)制研究中，某一細(xì)胞類型的異常表型可能源于細(xì)胞內(nèi)在缺陷，也可能由外部微環(huán)境誘導(dǎo)。本研究采用交叉移植實(shí)驗(yàn)（即將 A 來源的細(xì)胞移植至 B 來源的類器官中），通過觀察細(xì)胞表型的變化，有效區(qū)分了細(xì)胞自身與微環(huán)境的作用。該邏輯具有廣泛的遷移價(jià)值。例如，在研究環(huán)境污染物對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響時(shí)，可在類器官移植前后分別進(jìn)行暴露處理，以判斷其作用是直接損傷細(xì)胞，還是通過改變微環(huán)境間接發(fā)揮效應(yīng)。

3、功能驗(yàn)證應(yīng)超越表型標(biāo)志物的檢測(cè)

許多類器官研究以免疫熒光或單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析作為終點(diǎn)，重點(diǎn)在于確認(rèn)目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)特定標(biāo)志物。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展了體內(nèi)功能驗(yàn)證，包括突觸動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、損傷響應(yīng)實(shí)驗(yàn)和炎癥刺激下的形態(tài)變化分析。這些功能數(shù)據(jù)顯著提升了模型的生物學(xué)相關(guān)性與應(yīng)用價(jià)值。即便缺乏雙光子顯微鏡等高端設(shè)備，功能驗(yàn)證仍可通過其他方式實(shí)現(xiàn)，如電生理記錄神經(jīng)元放電、鈣成像檢測(cè)細(xì)胞響應(yīng)、吞噬實(shí)驗(yàn)評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞活性等。關(guān)鍵在于證明細(xì)胞不僅「形態(tài)相似」，更具「功能一致性」。

4、研究思路的選擇：干濕結(jié)合策略

該研究發(fā)表于 2023 年，是類器官領(lǐng)域的重要成果。Gage 團(tuán)隊(duì)在類器官移植方面具有長(zhǎng)期積累，其 2018 年發(fā)表于《Nature Biotechnology》的研究已建立腦類器官移植的基本框架，而本研究進(jìn)一步補(bǔ)充了小膠質(zhì)細(xì)胞這一關(guān)鍵組分。

需要指出的是，該模型仍存在一定局限性。例如，移植所用免疫缺陷小鼠無法用于研究適應(yīng)性免疫的參與；類器官中的血管來源于宿主小鼠而非人源，可能影響涉及人源血管信號(hào)通路的研究。盡管如此，這些限制并未削弱該模型在解析人源小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育與功能方面的核心價(jià)值。

對(duì)于經(jīng)費(fèi)有限或平臺(tái)條件不足的研究團(tuán)隊(duì)，并非必須復(fù)現(xiàn)該研究的全部實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。以環(huán)境暴露對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究為例，可優(yōu)先采用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)方法，利用公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)篩選與通路富集分析，作為前期預(yù)測(cè)手段。若預(yù)測(cè)結(jié)果指向具有明確生物學(xué)意義的信號(hào)通路（如 cGAS-STING 通路或鐵死亡相關(guān)通路），再進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。這種 「 干濕結(jié)合 」 的研究路徑，有助于在資源有限的情況下提高研究效率與成果產(chǎn)出。

參考文獻(xiàn)：

Schafer ST, Mansour AA, Schlachetzki JCM, Pena M, Ghassemzadeh S, Mitchell L, Mar A, Quang D, Stumpf S, Ortiz IS, Lana AJ, Baek C, Zaghal R, Glass CK, Nimmerjahn A, Gage FH. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 2023 May 11;186(10):2111-2126.e20.

編輯：冷漠小 z

題圖來源：自制

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