除靶基因自身序列因素外，DNA甲基化等表觀修飾也嚴(yán)重制約著靶基因編輯效率。DNA甲基化遍在于植物基因組中，與基因表達(dá)、染色質(zhì)重塑等重要的生物學(xué)過程相關(guān)，通常在胞嘧啶第5位加上甲基化修飾（5mC）【1】。近年來(lái)，基因編輯技術(shù)極大地促進(jìn)了基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究。其中，II型細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)CRISPR-Cas9和轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）在真核生物中的應(yīng)用最為廣泛。然而，特定位點(diǎn)的甲基化修飾抑制了基因編輯效率，甚至在某些高甲基化位點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)有效編輯【2】，給研究者造成困擾。研究表明，TALEN與DNA靶序列的識(shí)別機(jī)制完全不同于CRISPR-Cas9，其對(duì)異染色質(zhì)的結(jié)合和編輯效率優(yōu)于CRISPR-Cas9【3】。能否利用TALEN的上述優(yōu)勢(shì)對(duì)編輯元件進(jìn)行改造，在植物中提高其識(shí)別甲基化位點(diǎn)的特異性進(jìn)而提升基因編輯效率具有重要意義。

近日，深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心（蘭科中心）科研人員及其東京大學(xué)合作者在植物學(xué)國(guó)際知名期刊The Plant Journal在線發(fā)表了題為Using ngTALEN to improve genome editing efficiency on targets containing 5-methylcytosines的研究論文【4】，開發(fā)了利用ngTALEN核酸酶提高DNA甲基化靶位點(diǎn)基因編輯效率的有效方法。

研究人員首先結(jié)合單堿基水平甲基化數(shù)據(jù)，選擇開花調(diào)控相關(guān)Flowering wageningen (FWA) 為靶標(biāo)基因，針對(duì)啟動(dòng)子雙串聯(lián)重復(fù)區(qū)和基因區(qū)甲基化位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)3個(gè)靶位點(diǎn)（圖A）。相應(yīng)靶向區(qū)域在野生型植物中高度甲基化，而在表觀突變體fwa中為去甲基化狀態(tài)。然后，通過獲得CRISPR-Cas9、TALEN、ngTALEN的轉(zhuǎn)基因材料，在重疊編輯窗口、較長(zhǎng)時(shí)間跨度中考察甲基化對(duì)靶基因編輯效率的影響及編輯事件的可遺傳性和穩(wěn)定性。研究結(jié)果顯示，各編輯器在fwa表觀突變體背景下的基因編輯效率顯著高于野生型對(duì)照，表明甲基化狀態(tài)抑制基因編輯。與CRISPR-Cas9和TALEN相比，ngTALEN可有效提升甲基化啟動(dòng)子和基因區(qū)的編輯效率（圖B）。這可能與基因編輯元件的蛋白表達(dá)水平無(wú)直接聯(lián)系，因?yàn)楸M管CRISPR-Cas9在甲基化位點(diǎn)的編輯效率相對(duì)較低，其表達(dá)水平卻高出TALEN和ngTALEN表達(dá)水平6倍以上（圖C）。通過對(duì)約1000個(gè)單株進(jìn)行測(cè)序?qū)Ρ确治霰砻?，甲基化抑制CRISPR-Cas9和TALEN基因編輯效率（圖D），TALEN較CRISPR-Cas9有明顯優(yōu)勢(shì)，而ngTALEN對(duì)高甲基化位點(diǎn)的編輯效率為最優(yōu)。因此，該研究開發(fā)了應(yīng)對(duì)基因組DNA高甲基化位點(diǎn)的基因編輯工具，為難以編輯位點(diǎn)突變提供了實(shí)用工具。

值得注意的是，雖然該研究證明啟動(dòng)子區(qū)和基因區(qū)甲基化均可抑制基因編輯，并利用ngTALEN有效提高了DNA甲基化位點(diǎn)的編輯效率，但ngTALEN對(duì)基因組中普遍存在的其他復(fù)雜表觀修飾如組蛋白甲基化和乙酰化等位點(diǎn)的編輯作用有限。因此，下一步利用通用型RVD來(lái)識(shí)別胞嘧啶C和甲基化胞嘧啶5mC，結(jié)合對(duì)異染色質(zhì)可及性的調(diào)控，可望大幅提升基因編輯元件對(duì)復(fù)雜表觀修飾位點(diǎn)的基因編輯效率。

ngTALEN提升DNA甲基化位點(diǎn)編輯效率。A: 野生型Col-0和fwa-d表觀突變體背景下的FWA位點(diǎn)甲基化對(duì)比分析模式圖。B: 編輯效率對(duì)比分析。C: 基因編輯器表達(dá)水平對(duì)比分析。D. 測(cè)序結(jié)果匯總對(duì)比分析。

深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心副研究員王志才為該論文第一作者，王志才和東京大學(xué)有村慎一教授為論文共同通訊作者。該研究得到了國(guó)家留學(xué)基金委員會(huì)訪問學(xué)者項(xiàng)目的支持。

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[4] Wang Zhicai, Tamura Yoshiko, Hashimoto Masaru, Nakazato Issei, Yamaguchi-Nishimura Asuka, Arimura Shin-ichi. Using ngTALEN to improve genome editing efficiency on targets containing 5-methylcytosines. Plant J (2026)126, e70826.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.70826