導(dǎo)讀

蛋白-蛋白相互作用是調(diào)控細胞增殖、遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程的核心機制。深入解析蛋白互作與細胞行為之間的動態(tài)關(guān)系，對于理解腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥機制以及開發(fā)精準(zhǔn)治療策略具有重要意義。然而，傳統(tǒng)檢測方法（如Co-IP、Western blot）依賴細胞裂解，只能提供群體平均化的“靜態(tài)快照”，無法反映單個活細胞內(nèi)的真實動態(tài)。雙分子熒光互補技術(shù)雖可實現(xiàn)活細胞成像，但其大分子量熒光蛋白標(biāo)簽（>10 kDa）可能干擾蛋白天然功能，且轉(zhuǎn)染效率低，難以實現(xiàn)高通量單細胞分析。

針對活細胞中蛋白互作檢測效率低、通量不足等挑戰(zhàn)，北京航空航天大學(xué)常凌乾、董再再，香港城市大學(xué)焦艷麗，北京航空航天大學(xué)張靖（共同通訊作者）合作報道了一種名為“Pixar”的高通量單細胞生物芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)集成了蛇形微通道單細胞捕獲陣列與納米孔聚焦電場遞送模塊，能夠同時對數(shù)千個單細胞進行精準(zhǔn)定位與高效分子遞送。通過遞送小分子肽標(biāo)簽（His/Flag，<1 kDa）標(biāo)記的蛋白表達質(zhì)粒及特異性DNA探針，Pixar系統(tǒng)實現(xiàn)了活細胞中蛋白互作的高靈敏、可視化檢測，遞送效率與細胞活性均超過90%，成功避免了傳統(tǒng)大分子標(biāo)簽對蛋白功能的干擾。基于該系統(tǒng)，研究團隊揭示了AKT-mTOR蛋白互作增強對腫瘤細胞遷移和增殖異質(zhì)性的調(diào)控作用，為精準(zhǔn)腫瘤治療提供了新的單細胞層面的理論依據(jù)（圖1）。成果以“High-Throughput Single-Cell Biochip System for Functional Interrogation of Protein Interactions in Living Cells”為題，發(fā)表在《Small》上。論文第一作者為北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生劉馮、安徽醫(yī)科大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院碩士研究生吳成寶、北京航空航天大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院副教授楊超娟、北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生童一航。

圖1. Pixar系統(tǒng)工作原理及單細胞蛋白互作檢測流程

Pixar系統(tǒng)首先通過蛇形微通道中的鉤狀微結(jié)構(gòu)，利用流體偏轉(zhuǎn)力實現(xiàn)了高通量單細胞捕獲（>1000個細胞/芯片，捕獲效率>90%）。隨后，利用納米孔聚焦電場技術(shù)，在30V低電壓下實現(xiàn)細胞膜可逆電穿孔，將His/Flag小肽標(biāo)簽標(biāo)記的AKT和mTOR表達質(zhì)粒以及特異性DNA探針高效遞送至活細胞內(nèi)（遞送效率>96%，細胞活性>98%）。小分子肽標(biāo)簽（<1 kDa）相比傳統(tǒng)熒光蛋白標(biāo)簽（>10 kDa）對蛋白天然構(gòu)象和功能影響更小，同時探針通過適配體特異性識別肽標(biāo)簽，結(jié)合鏈置換信號放大策略，實現(xiàn)了蛋白互作信號4倍增強，檢測靈敏度達1 nM（圖2）。

圖2. Pixar系統(tǒng)單細胞捕獲與分子遞送性能驗證

基于上述技術(shù)優(yōu)勢，研究團隊利用Pixar系統(tǒng)對AKT-mTOR蛋白互作進行了單細胞水平的動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果顯示，AKT-mTOR互作增強顯著促進了腫瘤細胞的遷移和增殖能力，且不同細胞間表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性響應(yīng)。通過蛋白組學(xué)分析，共鑒定出641個差異表達蛋白，GO和KEGG富集分析表明這些蛋白主要參與糖酵解、細胞黏附、代謝調(diào)控等通路，揭示了AKT-mTOR互作調(diào)控腫瘤細胞行為異質(zhì)性的分子網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖3. Pixar系統(tǒng)監(jiān)測AKT-mTOR互作調(diào)控腫瘤細胞異質(zhì)性

為進一步驗證Pixar系統(tǒng)的普適性，研究團隊選擇了另一對經(jīng)典癌蛋白KRAS-Raf1進行了驗證。結(jié)果表明，Pixar系統(tǒng)同樣能夠高效遞送KRAS和Raf1表達質(zhì)粒，并成功檢測到二者在活細胞中的特異性互作信號。經(jīng)KRAS抑制劑處理后，熒光信號顯著降低，證實了檢測的特異性。以上結(jié)果充分證明Pixar系統(tǒng)具有良好的通用性，適用于多種蛋白互作的研究場景（圖4）。

圖4. Pixar系統(tǒng)在AKT-mTOR蛋白互作檢測中的應(yīng)用驗證

綜上所述，Pixar系統(tǒng)集高效遞送、多靶標(biāo)檢測、長時程單細胞表型監(jiān)測于一體，為藥物篩選、基礎(chǔ)生物學(xué)研究及個性化醫(yī)療提供了全新的技術(shù)平臺。

文章鏈接：https://doi.org/10.1002/smll.73336

來源：北京航空航天大學(xué)