2025年3月21日，浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院邱萍、浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理李昌煜、浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院醫(yī)學(xué)科研中心陳方明及浙江工商大學(xué)海洋食品研究院沈清教授研究團(tuán)隊(duì)在Food Research International（IF=8，中科院1區(qū)-TOP期刊）在線發(fā)表題為“Vine tea (Ampelopsis grossedentata) ameliorates chronic alcohol-induced hepatic steatosis, oxidative stress, and inflammation via YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 axis”（藤茶（顯齒蛇葡萄，Ampelopsis grossedentata）通過(guò) YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 軸改善慢性酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性、氧化應(yīng)激和炎癥）的研究論文。

該研究聚焦酒精相關(guān)性肝?。ˋLD）這一由長(zhǎng)期過(guò)量飲酒驅(qū)動(dòng)、臨床治療手段仍較為有限的重要肝臟疾病，圍繞傳統(tǒng)茶藥兩用植物莓茶（蛇葡萄，Ampelopsis grossedentata）的護(hù)肝作用及其分子機(jī)制開(kāi)展了系統(tǒng)研究。作者首先利用 UPLC-Q-TOF-MS 對(duì)莓茶提取物（AGE）的化學(xué)成分進(jìn)行分析，鑒定出包括二氫楊梅素、楊梅素、二氫槲皮素等在內(nèi)的多種主要成分；隨后在 Lieber-DeCarli 飲食誘導(dǎo)的慢性酒精性肝損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，AGE 可顯著降低 ALT、AST、ALP、LDH、肝臟 TG 和 TNF-α 水平，減輕脂質(zhì)沉積、炎癥浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激和線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，并改善 MDA、GSH 等氧化還原指標(biāo)。進(jìn)一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)、WGCNA 和單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘，研究將 m6A 讀取蛋白 YTHDF2 鎖定為 AGE 干預(yù) ALD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并揭示其下游與 PGC-1α/SIRT3 線粒體代謝和抗氧化通路密切相關(guān)。臨床肝組織樣本、免疫熒光和單細(xì)胞軌跡分析進(jìn)一步提示，ALD 狀態(tài)下 YTHDF2 上調(diào)，而 PGC-1α 和 SIRT3 受抑，且高表達(dá) YTHDF2 與肝細(xì)胞分化受阻、炎癥浸潤(rùn)增強(qiáng)相關(guān)。功能驗(yàn)證方面，體內(nèi)敲低 Ythdf2 可部分模擬 AGE 的保護(hù)效應(yīng)，減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷、脂肪變和氧化應(yīng)激；體外在 THLE-2 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) YTHDF2 則會(huì)削弱 AGE 對(duì) ROS 升高、線粒體功能下降及 PGC-1α/SIRT3 失衡的糾正作用。整體來(lái)看，這項(xiàng)工作不只是再次證明了莓茶具有抗酒精性肝損傷的活性，更重要的是首次將其作用機(jī)制明確指向 YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 這一“m6A調(diào)控—線粒體穩(wěn)態(tài)—氧化應(yīng)激”關(guān)鍵軸線，把傳統(tǒng)藥食資源與表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控機(jī)制連接起來(lái)，為酒精相關(guān)性肝病的干預(yù)提供了一個(gè)較有新意的天然產(chǎn)物研究范式。當(dāng)然，本文目前仍主要停留在動(dòng)物和細(xì)胞層面的機(jī)制驗(yàn)證階段，AGE 中具體發(fā)揮主導(dǎo)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、YTHDF2 對(duì) PGC-1α 的直接調(diào)控方式以及后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值，仍有待進(jìn)一步深入研究，但其作為“傳統(tǒng)茶資源＋新機(jī)制靶點(diǎn)”結(jié)合的代表性工作，已有較強(qiáng)的延展?jié)摿蛻?yīng)用想象空間。

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【摘 要】

千余年來(lái)，蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）W. T. Wang）的葉片，即“莓茶”，一直被視為一種廣受歡迎的茶飲和傳統(tǒng)草藥，具有抗氧化、抗炎、護(hù)肝和抗病毒等作用。近年來(lái)，酒精相關(guān)性肝損傷的發(fā)生率持續(xù)上升，已對(duì)全球公共衛(wèi)生造成沉重負(fù)擔(dān)。既往研究表明，莓茶提取物（AGE）能夠改善酒精相關(guān)性肝?。ˋLD），但其發(fā)揮作用的藥理機(jī)制仍不清楚。

本研究首先采用 UPLC-Q-TOF-MS 對(duì) AGE 的化學(xué)成分進(jìn)行分析。隨后，在飼喂 Lieber-DeCarli 飲食的小鼠中建立 ALD 模型，并通過(guò)生化指標(biāo)及肝臟病理變化評(píng)估 AGE 的護(hù)肝作用。此外，研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘等多種生物信息學(xué)方法，揭示 YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 信號(hào)軸可能是 AGE 發(fā)揮抗 ALD 作用的潛在機(jī)制。進(jìn)一步結(jié)合 Western blot 和免疫熒光染色，對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行了驗(yàn)證。

研究結(jié)果顯示，給予莓茶后，可顯著減輕慢性乙醇誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激和炎癥。值得注意的是，敲低 YTHDF2 也可部分保護(hù)肝臟免受乙醇誘導(dǎo)的損傷。從機(jī)制上看，生物信息學(xué)分析以及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)共同表明，YTHDF2 是 AGE 治療 ALD 的關(guān)鍵藥理靶點(diǎn)，其作用通過(guò)下游 PGC-1α/SIRT3 通路實(shí)現(xiàn)。

總之，本研究首次證明，AGE 可通過(guò)抑制 YTHDF2、增強(qiáng) PGC-1α 和 SIRT3 的表達(dá)來(lái)減輕乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。作為一種兼具獨(dú)特藥用價(jià)值的茶食品，莓茶在 ALD 治療方面展現(xiàn)出顯著潛力和應(yīng)用價(jià)值。

01

研究背景及科學(xué)問(wèn)題

酒精相關(guān)性肝?。ˋLD）是由長(zhǎng)期過(guò)量飲酒引起的重要健康問(wèn)題，可導(dǎo)致脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化和/或肝細(xì)胞癌。ALD 是全球范圍內(nèi)肝病相關(guān)發(fā)病和死亡的重要原因，對(duì)公共健康構(gòu)成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，過(guò)量飲酒每年約造成 300 萬(wàn)例死亡，占全部死亡的 5.3%，并占全球肝硬化相關(guān)死亡的 47.9%。目前，糖皮質(zhì)激素被推薦用于治療重癥酒精性肝炎以降低短期死亡率，但其臨床應(yīng)用受到諸多限制。此外，己酮可可堿、F652 及益生菌等治療策略仍處于臨床試驗(yàn)階段。因此，隨著 ALD 所致肝病負(fù)擔(dān)不斷加重，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)并開(kāi)發(fā)更有效的臨床藥物。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最常見(jiàn)的 mRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾形式，參與調(diào)控多種生理過(guò)程。這種動(dòng)態(tài)且可逆的修飾由“寫(xiě)入蛋白”產(chǎn)生，由“擦除蛋白”去除，并由“讀取蛋白”識(shí)別。近期研究表明，m6A 調(diào)控因子的異常會(huì)導(dǎo)致顯著的肝臟病理和生理功能障礙，進(jìn)而影響脂質(zhì)代謝、非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝炎等過(guò)程。例如，在非酒精性脂肪性肝病中，脂質(zhì)過(guò)載可導(dǎo)致 YTHDF2 和 AKT1 缺乏，使 YTHDF2 對(duì) m6A 甲基化 circ-SLC9A6 的降解減少，從而造成脂質(zhì)代謝紊亂。然而，m6A 甲基化在 ALD 中的作用及其調(diào)控機(jī)制仍研究不足。探索 m6A 調(diào)控因子的變化，可能為理解 ALD 的發(fā)病、進(jìn)展及潛在治療靶點(diǎn)提供關(guān)鍵線索。

蛇葡萄嫩莖葉即莓茶，在中國(guó)傳統(tǒng)草本茶飲中具有悠久歷史。蛇葡萄提取物（AGE）具有廣泛生物活性，包括顯著的抗氧化、抗炎和降糖作用。研究表明，AGE 對(duì)包括 ALD、非酒精性脂肪性肝病和急性肝損傷在內(nèi)的多種肝臟疾病具有明顯保護(hù)作用。目前研究已發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄的主要植物化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、萜類(lèi)和多酚類(lèi)化合物。其中，二氫楊梅素（DMY）是莓茶中最主要的活性黃酮，因其抗炎、護(hù)肝和降糖作用而受到廣泛關(guān)注，并已在許多國(guó)家作為膳食補(bǔ)充劑使用。

當(dāng)前，高通量生物信息學(xué)平臺(tái)已被廣泛用于系統(tǒng)研究體內(nèi)基因表達(dá)變化，是闡明傳統(tǒng)藥物生物學(xué)機(jī)制的重要工具。本研究整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析及單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘等前沿生物信息學(xué)方法，建立了 m6A 調(diào)控因子 YTHDF2 與 ALD 進(jìn)展之間的新聯(lián)系。我們證明，YTHDF2 是 AGE 緩解慢性酒精攝入所致肝脂肪變和氧化應(yīng)激的重要靶點(diǎn)，并進(jìn)一步揭示了莓茶通過(guò) YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 軸改善 ALD 的新機(jī)制。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點(diǎn)

3.1 AGE 的化學(xué)成分分析（圖1A–E）

采用 70% 乙醇提取蛇葡萄后，所得凍干提取物產(chǎn)率為 46%（圖1A–C）。利用 UPLC-Q-TOF-MS 對(duì) AGE 的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過(guò)與 TCM MS/MS 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在正、負(fù)離子模式下共鑒定出 35 種化合物。AGE 的主要成分包括二氫楊梅素、楊梅素、二氫槲皮素、哌啶酸、槲皮苷、沒(méi)食子酸和根皮苷等（圖1D–E）。

Fig. 1. UPLC-Q-TOF-MS analysis of AGE ingredients.(A) Tender stems and leaves of Ampelopsis grossedentata. (B) The surface of dried A. grossedentata is accompanied by white DMY crystals. (C) 70 % ethanol extract of A. grossedentata leaf, lyophilized to a powder. (D) Total ion chromatograms in positive mode analysis. (E) Total ion chromatograms in negative mode analysis.

3.2 AGE 可減輕 ALD 小鼠的肝損傷（圖2A–J）

研究通過(guò)連續(xù) 7 周飼喂含乙醇飲食建立 ALD 小鼠模型（圖2A）。血清生化指標(biāo)顯示，與正常對(duì)照組相比，乙醇組小鼠的 ALT、AST、ALP 和 LDH 水平均顯著升高，提示慢性酒精攝入導(dǎo)致明顯肝功能損害。AGE（150 mg/kg 和 300 mg/kg）以及水飛薊素處理均能顯著改善這種肝損傷（圖2B–E）。

Fig. 2. AGE alleviates alcohol-induced liver injury.(A) Experimental design flowchart. (B-E) Serum ALT, AST, ALP, and LDH levels (n = 6). (F) H&E and oil red O staining showing pathological changes in the liver (×200), TEM analysis showing ultrastructural damage of hepatocytes (×30,000), LD: lipid droplet. (G) Hepatic TG levels (n = 6). (H) Hepatic TNF-α levels (n = 6). (I-J) Hepatic MDA and GSH levels (n = 6). The results are expressed as the mean ± SD, n = 6. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

H&E 和油紅 O 染色顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊、邊界清晰；而乙醇組存在明顯脂質(zhì)沉積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。AGE 和水飛薊素補(bǔ)充可明顯減輕乙醇誘導(dǎo)的異常病理改變。透射電鏡分析進(jìn)一步表明，乙醇喂養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積明顯，線粒體嵴遭到破壞；而 AGE 和水飛薊素處理后，脂滴明顯減少，線粒體形態(tài)得到恢復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列也趨于整齊（圖2F）。

此外，乙醇組肝組織 TG 水平顯著升高，而 AGE 和水飛薊素均可顯著降低該指標(biāo)（圖2G）。AGE 還能顯著降低肝臟 TNF-α 水平，提示其具有改善炎癥的作用（圖2H）。在抗氧化方面，乙醇組肝臟 MDA 水平明顯升高，而 GSH 水平顯著下降；AGE 處理則明顯逆轉(zhuǎn)了這些異常變化（圖2I–J）。這些結(jié)果表明，AGE 對(duì) ALD 具有劑量依賴(lài)性的護(hù)肝作用。

3.3 ALD 中差異表達(dá) m6A 調(diào)控因子的鑒定及免疫浸潤(rùn)分析（圖3A–H）

研究利用 GSE28619 和 GSE142530 數(shù)據(jù)集分析 ALD 患者與正常人肝組織中 26 個(gè) m6A 調(diào)控基因的表達(dá)譜，共鑒定出 12 個(gè)差異表達(dá)的 m6A 基因，其中包括 2 個(gè)寫(xiě)入蛋白、9 個(gè)讀取蛋白和 1 個(gè)擦除蛋白。熱圖和箱線圖顯示，與健康對(duì)照相比，ALD 樣本中 YTHDF2 和 HNRNPC 顯著上調(diào)，而 METTL3、ZC3H13、YTHDC1、YTHDF1、FMR1、LRPPRC、HNRNPA2B1、IGFBP1、IGFBP3 和 ALKBH5 下調(diào)（圖3A–B）。

Fig. 3. Identification of DE-m6A regulators in ALD and analysis of immune cell infiltration.(A-B) Expression of m6A regulatory factors in normal and ALD liver tissue. Healthy controls, n = 7; ALD, n = 15. (C) ALD patients were categorized into two m6A patterns using consensus clustering analysis (k = 2). (D-E) Expression of m6A regulators in clusters A and B. (F-G) Abundance of immune cell infiltration in clusters A and B. (H) Spearman correlation analysis of m6A regulators and infiltrating immune cells, red: positive correlation, blue: negative correlation. In all heat maps, the change of expression value is represented by log|FC|, red: upregulated, blue: down-regulated. The results are expressed as the mean ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

基于這 12 個(gè)關(guān)鍵 m6A 調(diào)控因子，研究進(jìn)一步進(jìn)行一致性聚類(lèi)分析，結(jié)果表明當(dāng) k=2 時(shí)分群效果最佳，因此將樣本分為 m6A cluster A 和 cluster B 兩種模式（圖3C）。兩類(lèi)之間在 METTL14、YTHDF1 和 YTHDF2 的表達(dá)上存在顯著差異（圖3D–E）。

隨后，研究采用 ssGSEA 比較 cluster A 和 cluster B 的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度，共識(shí)別出 23 類(lèi)免疫細(xì)胞，其中 cluster B 中大多數(shù)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度均明顯高于 cluster A（圖3F–G）。進(jìn)一步 Spearman 相關(guān)分析顯示，大多數(shù) m6A 調(diào)控因子與免疫細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，而 YTHDF2 與多類(lèi)免疫細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，包括活化樹(shù)突細(xì)胞、未成熟樹(shù)突細(xì)胞、MDSCs、肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹(shù)突細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞、濾泡輔助性 T 細(xì)胞和 1 型輔助性 T 細(xì)胞等（圖3H）。這提示在 ALD 肝臟中，YTHDF2 的高表達(dá)可能增強(qiáng)相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而影響免疫微環(huán)境。

3.4 YTHDF2 是介導(dǎo) AGE 干預(yù) ALD 的關(guān)鍵 m6A 調(diào)控因子（圖4A–H）

為了篩選 ALD 的特征性 m6A 調(diào)控因子，研究采用 LASSO 回歸和 SVM-RFE 兩種機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì) 12 個(gè)差異表達(dá) m6A 因子進(jìn)行預(yù)測(cè)。LASSO 回歸分析提示，YTHDF1、YTHDF2、HNRNPC、FMR1、HNRNPA2B1、IGFBP1、IGFBP3 和 ALKBH5 這 8 個(gè)因子可能與 ALD 進(jìn)展相關(guān)（圖4A）。SVM-RFE 進(jìn)一步將范圍縮小至 2 個(gè)因子：YTHDF2 和 RBM15（圖4B–C）。

Fig. 4. Identification of key m6A regulators mediating AGE intervention in ALD.(A) Coefficients obtained from Lasso regression analysis and selection of tuning parameters through 1000 cross-validations. (B) Application of the SVM-REF approach to identify signature genes in ALD and normal samples. (C) Venn diagram illustrating the overlap of m6A regulatory factors identified by both algorithms. (D, E) ROC curve for predicting prevalence in the GSE28619 and GSE142530 dataset, AUC (Area Under the Curve): the area under the ROC curve. A higher AUC value, approaching 1, indicates better diagnostic performance and greater accuracy of the metric. (F) Volcano plots displaying DEGs in the RNA-seq data, red: significant up-regulation, blue: significant down-regulation, grey: no significant difference. (G) Heatmap showing the expression of m6A genes in the RNA-seq data, gene expression changes are represented by log|FC|, red: up-regulated, blue: down regulated. (H) Venn diagram depicting the overlap of DEGs in the transcriptome and machine learning results. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

以 GSE28619 為訓(xùn)練集、GSE142530 為驗(yàn)證集繪制 ROC 曲線后發(fā)現(xiàn)，YTHDF2 和 RBM15 在訓(xùn)練集中的 AUC 分別為 0.99 和 1.0，顯示出很高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性（圖4D）；在驗(yàn)證集中 AUC 分別為 0.575 和 0.633，仍具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值（圖4E）。這些結(jié)果提示，YTHDF2 和 RBM15 可能作為 ALD 的特征性 m6A 調(diào)控因子，具有一定診斷意義。

為進(jìn)一步驗(yàn)證 AGE 干預(yù) ALD 時(shí)所涉及的關(guān)鍵 m6A 因子，研究對(duì) ALD 小鼠肝臟進(jìn)行了 RNA-seq 分析，結(jié)果在 EtOH vs. normal 比較中獲得 3106 個(gè)差異基因，在 AGE vs. EtOH 比較中獲得 1214 個(gè)差異基因（圖4F）。RNA-seq 熱圖展示了 12 個(gè) m6A 基因的表達(dá)變化（圖4G）。綜合轉(zhuǎn)錄組和機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)果后，研究認(rèn)為 YTHDF2 可能是介導(dǎo) AGE 干預(yù) ALD 的關(guān)鍵 m6A 調(diào)控因子（圖4H）。

3.5 生物信息學(xué)分析揭示 PGC-1α/SIRT3 是 YTHDF2 的下游通路（圖5A–H）

為進(jìn)一步探究 YTHDF2 的下游調(diào)控靶點(diǎn)，研究對(duì) GSE28619 數(shù)據(jù)集進(jìn)行了 WGCNA 分析。通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)并合并高度相關(guān)模塊，共識(shí)別出 13 個(gè)模塊（圖5A）。其中，黑色模塊與 ALD 表型的相關(guān)性最強(qiáng)（R=0.95，P=2e?11，圖5B），且該模塊中模塊成員度與基因顯著性之間也具有很高相關(guān)性（圖5C）。

Fig. 5. Bioinformatics analysis revealing downstream targets regulated by YTHDF2 in ALD.(A) Initial and combined modules beneath the tree of clustering. (B) Module-trait correlation heat map showing the correlation between clinical traits for normal control subjects [C] and patients with ALD [P], red: positive correlation, blue: negative correlation. (C) Correlation between the module membership and gene significance in the black module. (D) Venn diagram depicting the overlapping targets of M6A2Target and WGCNA. (E) Depiction of the SVM-REF approach to identify signature genes in ALD and normal samples. (F) Venn diagram depicting the overlap of 5 sources: ALD-related targets, DEGs from GEO (N > 3), PGC-1α downstream targets (IPA), mitochondria-related genes, and DEGs from RNAseq data (AGE vs. EtOH). (G) Relative expression of 10 genes in the mouse liver transcriptome (n = 3). (H) SIRT3 immunohistochemistry in mouse liver. The results are presented as the mean ± SD, n = 3. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

隨后，將黑色模塊中的 2558 個(gè)基因與 M6A2Target 數(shù)據(jù)庫(kù)中 YTHDF2 的 97 個(gè)靶基因進(jìn)行交集分析，最終篩得 19 個(gè) ALD 中受 YTHDF2 調(diào)控的下游基因（圖5D）。進(jìn)一步應(yīng)用 SVM-RFE 算法，從中識(shí)別出 8 個(gè)關(guān)鍵基因：IRS1、EGFR、NR1H3、LHPP、CREBBP、LATS1、GADD45A 和 PPARGC1A（圖5E）。

PPARGC1A 編碼蛋白為 PGC-1α。既往研究表明，PGC-1α 的激活可通過(guò)抑制脂質(zhì)代謝紊亂和線粒體 ROS 過(guò)量生成來(lái)緩解 ALD，因此作者推測(cè)其可能是 YTHDF2 在 ALD 中的重要調(diào)控靶點(diǎn)。進(jìn)一步整合 PGC-1α 下游基因、GEO 高頻差異基因、ALD 相關(guān)靶點(diǎn)、線粒體相關(guān)基因以及 AGE 影響的差異基因后，最終聚焦到 10 個(gè)重疊基因：PIK3R1、EGFR、ACACB、FGF21、GDF15、SIRT3、FABP4、CEBPA、CEBPB 和 TIMP2（圖5F）。其中，轉(zhuǎn)錄組柱狀圖顯示了這些基因在小鼠肝臟中的相對(duì)表達(dá)變化（圖5G）。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)分析，研究最終確定 SIRT3 為 PGC-1α 的關(guān)鍵下游信號(hào)分子（圖5H）。由于 SIRT3 蛋白僅定位于線粒體，因此推測(cè) AGE 可能通過(guò)調(diào)控 PGC-1α/SIRT3 通路改善線粒體功能，從而緩解 ALD。

3.6 高表達(dá) YTHDF2 延緩肝細(xì)胞分化并抑制 PGC-1α/SIRT3 表達(dá)（圖6A–J）

為了明確 YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 信號(hào)軸是否在肝細(xì)胞中被特異調(diào)控，研究下載了 ALD 患者單細(xì)胞數(shù)據(jù)集 GSE236382，并鑒定出 8 種主要細(xì)胞類(lèi)型（圖6A）。氣泡圖顯示，YTHDF2、PPARGC1A 和 SIRT3 在肝細(xì)胞中具有較高表達(dá)豐度（圖6B）。

Fig. 6. Single-cell data mining and staining of patient biopsy samples.(A) UMAP plot of all 5 integrated samples, identified by cell type (GSE236382). (B) Bubble plot depicting the expression levels of YTHDF2, PPARGC1A, and SIRT3 in each cell subtype. (C) Trajectory analysis showing the effects of high and low YTHDF2 expression on hepatocyte differentiation fate. (D) Trajectory exhibited state-specific progression patterns in hepatocytes. (E) Pseudotime analysis of hepatocytes. (F) UMAP plot of all integrated samples, identified by cell type (GSE136103). (G) Bubble plot showing YTHDF2 expression levels in each cell subtype and under differential conditions. (H) H&E staining of normal and ALD liver samples in humans (200×). (I) Immunofluorescence staining of YTHDF2 and PGC-1α in human liver samples (400×). (J) Immunofluorescence staining of SIRT3 in human liver samples (400×).

對(duì)全部肝細(xì)胞分化軌跡的時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)，不同水平的 YTHDF2 表達(dá)會(huì)顯著改變肝細(xì)胞分化命運(yùn)。在發(fā)育軌跡中，低表達(dá) YTHDF2 的肝細(xì)胞位于分支點(diǎn) 1、2 和 3，而隨后出現(xiàn)兩支高表達(dá) YTHDF2 的肝細(xì)胞分支（圖6C），并進(jìn)一步形成 11 個(gè)分化狀態(tài)（圖6D）。值得注意的是，低 YTHDF2 表達(dá)的肝細(xì)胞主要位于較晚分化階段，而高 YTHDF2 表達(dá)的肝細(xì)胞偽時(shí)間值較低，提示其發(fā)育和分化程度更低（圖6E）。

研究進(jìn)一步分析了另一單細(xì)胞數(shù)據(jù)集 GSE136103，共鑒定出 15 種主要細(xì)胞類(lèi)型（圖6F）。結(jié)果同樣顯示，與健康個(gè)體相比，ALD 患者肝細(xì)胞中的 YTHDF2 表達(dá)明顯更高（圖6G）。

為了驗(yàn)證 ALD 中 YTHDF2、PGC-1α 和 SIRT3 的變化，研究收集了 ALD 患者肝組織樣本進(jìn)行病理分析。H&E 染色顯示，ALD 組存在明顯炎癥浸潤(rùn)和脂肪變性（圖6H）。免疫熒光染色進(jìn)一步顯示，與健康樣本相比，ALD 樣本中 YTHDF2 蛋白表達(dá)明顯升高，而 PGC-1α 和 SIRT3 的表達(dá)顯著降低（圖6I–J）。這些結(jié)果提示，在 ALD 中，YTHDF2 介導(dǎo)了肝細(xì)胞發(fā)育分化延遲以及 PGC-1α/SIRT3 表達(dá)失衡。

3.7 敲低 Ythdf2 可減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷（圖7A–G）

研究通過(guò) AAV 介導(dǎo)構(gòu)建 Ythdf2 敲低小鼠，并給予含酒精飲食。結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，乙醇處理可顯著升高血清 ALT、AST、ALP 及肝臟 TG、MDA 水平，并降低 GSH 水平；而敲低 Ythdf2 可明顯緩解這些酒精誘導(dǎo)的肝功能損傷和氧化應(yīng)激改變（圖7A–F）。

Fig. 7. YTHDF2 deletion alleviates alcohol-induced liver damage.(A-C) Serum levels of ALT, AST and ALP in mice (n = 6). (D–F) Hepatic levels of TG, MDA and GSH in mice (n = 6). (G) H&E and oil red O staining of mouse liver tissues (400×). The results are presented as the mean ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, ns (non-significant). (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

從組織學(xué)角度看，Ythdf2 敲低小鼠肝臟本身未見(jiàn)明顯異常；但在酒精處理?xiàng)l件下，Ythdf2 敲低可顯著減輕長(zhǎng)期飲酒所致的肝臟炎癥浸潤(rùn)和脂質(zhì)沉積（圖7G）。這些結(jié)果表明，酒精攝入可能通過(guò)上調(diào) YTHDF2 誘導(dǎo)肝損傷，而抑制 YTHDF2 表達(dá)則可降低肝細(xì)胞對(duì)乙醇損傷的敏感性。

3.8 AGE 通過(guò)抑制 YTHDF2 改善肝臟炎癥并糾正 PGC-1α/SIRT3 通路異常（圖8A–G）

為明確炎癥因子是否受 YTHDF2 調(diào)控，研究分析了 GSE28619、GSE142530 和 E-MTAB-2664 數(shù)據(jù)集中炎癥相關(guān)差異基因與 YTHDF2 的相關(guān)性（圖8A）。ELISA 結(jié)果顯示，與正常組相比，酒精誘導(dǎo)小鼠血清中的 CXCL5 和 CXCL10 水平均顯著升高；而 AGE（300 mg/kg）處理和 Ythdf2 敲低均可顯著降低這兩種趨化因子的水平（圖8B）。

Fig. 8. AGE improvements to hepatic inflammation and PGC-1α/SIRT3 expression are mediated by YTHDF2.(A) Spearman correlation analysis of YTHDF2 with 16 cytokines. (B) Serum levels of CXCL5 and CXCL10 in mice (n = 6).

進(jìn)一步檢測(cè)線粒體抗氧化酶 SOD2 和線粒體復(fù)合物 I 活性后發(fā)現(xiàn)，酒精暴露顯著降低二者水平，而 AGE（300 mg/kg）處理及 Ythdf2 敲低均可明顯改善（圖8C–D）。隨后檢測(cè) YTHDF2、PGC-1α 和 SIRT3 的表達(dá)變化。RT-qPCR 結(jié)果顯示，酒精處理可損傷 PGC-1α mRNA 表達(dá)，而 AGE 和 Ythdf2 敲低均可恢復(fù)這一變化（圖8E）。Western blot 結(jié)果進(jìn)一步表明，長(zhǎng)期酒精攝入可顯著升高 YTHDF2 表達(dá)，同時(shí)降低 PGC-1α 和 SIRT3 表達(dá)，而 AGE（300 mg/kg）可明顯逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)；同時(shí)，Ythdf2 敲低也可顯著阻止酒精誘導(dǎo)的 PGC-1α/SIRT3 通路紊亂（圖8F）。免疫熒光染色顯示出一致的表達(dá)趨勢(shì)（圖8G）。

這些結(jié)果表明，Ythdf2 敲低可恢復(fù) PGC-1α 的 mRNA 和蛋白水平，AGE 可能正是通過(guò)抑制 YTHDF2 來(lái)糾正 ALD 中 PGC-1α/SIRT3 通路的失衡。

3.9 AGE 通過(guò) YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 軸在體外降低 ROS 水平（圖9A–E）

為了進(jìn)一步闡明 YTHDF2 在 AGE 作用機(jī)制中的參與，研究在 THLE-2 細(xì)胞中考察了 YTHDF2 過(guò)表達(dá)對(duì)酒精損傷及 AGE 干預(yù)效果的影響。CCK8 結(jié)果顯示，AGE 可顯著改善酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降，而 YTHDF2 過(guò)表達(dá)則會(huì)進(jìn)一步加重酒精暴露后的細(xì)胞死亡，并削弱 AGE 的保護(hù)作用（圖9A）。

Fig. 9. AGE reduces the ROS levels through the YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 axis in THLE-2 cells.

鑒于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝損傷在 ALD 中具有關(guān)鍵作用，研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。結(jié)果顯示，酒精暴露顯著增加 ROS 生成，而 AGE 處理可明顯降低 ROS 水平；與單純酒精刺激相比，YTHDF2 過(guò)表達(dá)會(huì)進(jìn)一步加重酒精誘導(dǎo)的氧化損傷，并削弱 AGE 的改善作用（圖9B）。與 ROS 變化相反，乙醇損傷導(dǎo)致線粒體復(fù)合物 I 活性下降，而 AGE 可提升其活性；但在 YTHDF2 過(guò)表達(dá)條件下，這一改善作用明顯減弱（圖9C）。

研究還進(jìn)一步檢測(cè)了 YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 軸的表達(dá)。RT-qPCR 結(jié)果表明，酒精刺激可顯著降低 PGC-1α mRNA 水平，而 AGE 可緩解該變化；但 YTHDF2 過(guò)表達(dá)會(huì)進(jìn)一步降低酒精條件下的 PGC-1α mRNA 水平，從而抑制 AGE 的有益作用，這可能與 YTHDF2 促進(jìn) PGC-1α mRNA 降解有關(guān)（圖9D）。Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，酒精處理可顯著升高 YTHDF2 蛋白表達(dá)，并明顯降低 PGC-1α/SIRT3 表達(dá)；AGE 能有效逆轉(zhuǎn)這些變化。而在 YTHDF2 過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，酒精對(duì) PGC-1α/SIRT3 的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，AGE 對(duì) PGC-1α/SIRT3 的提升作用則明顯減弱（圖9E）。

總體來(lái)看，這些結(jié)果表明，YTHDF2 過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)乙醇損傷的敏感性，而 AGE 可能通過(guò)調(diào)控 YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 信號(hào)軸來(lái)減輕乙醇誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激。

【Citation】:Luo Q, Qiu J, Chen M, et al. Vine tea (Ampelopsis grossedentata) ameliorates chronic alcohol-induced hepatic steatosis, oxidative stress, and inflammation via YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 axis[J].Food Research International,2025, 209: 116321.

【貢獻(xiàn)】★★★★★

本文首次證明，莓茶提取物 AGE 能通過(guò)抑制 YTHDF2、增強(qiáng) PGC-1α 和 SIRT3 的表達(dá)，從而減輕乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。AGE 可顯著改善慢性酒精導(dǎo)致的肝脂肪變、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其關(guān)鍵機(jī)制與 YTHDF2/PGC-1α/SIRT3 信號(hào)軸密切相關(guān)。作為一種兼具食用和藥用價(jià)值的茶食品，莓茶在酒精相關(guān)性肝病的防治中具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

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