膠質(zhì)瘤是一組具有星形細胞、少突膠質(zhì)細胞及室管膜細胞表型特征的神經(jīng)上皮腫瘤總稱，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，WHO第5版中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類發(fā)布以來，分子檢測已成為病理整合診斷不可或缺的組成內(nèi)容。但目前膠質(zhì)瘤分子病理指標和檢測規(guī)范尚無統(tǒng)一認識。中華醫(yī)學會病理學分會腦神經(jīng)病理學組結(jié)合國內(nèi)外研究進展及實踐經(jīng)驗，就重要分子指標、診斷流程、技術(shù)優(yōu)劣及檢測路徑進行討論，討論形成膠質(zhì)瘤分子病理診斷的13條專家共識，為規(guī)范合理地開展膠質(zhì)瘤分子檢測提供參考，更加適合中國臨床實踐。

驅(qū)動膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病機制的基因改變

一、膠質(zhì)瘤中具有診斷價值的基因和染色體改變

主要為：IDH1/2 基因突變、染色體1p/19q共缺失、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因啟動子突變、CDKN2A/2B基因純合性缺失、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因變異、ATRX基因變異、全第7號染色體獲得/全第10號染色體丟失、MYB或MYBL1基因變異、BRAF基因變異、FGFR1/2/3基因變異、H3 K27突變、H3 G34突變、受體酪氨酸激酶(RTK)家族基因融合、PRKCA基因變異、MN1基因變異、TP53基因突變、ZFTA基因融合、YAP1基因融合、MGMT基因啟動子甲基化

膠質(zhì)瘤的臨床和分子分級

具體的內(nèi)容可以點擊查看上一篇推文：

二、整合病理診斷流程圖

成人型彌漫性膠質(zhì)瘤、兒童型彌漫性膠質(zhì)瘤、局限性星形細胞膠質(zhì)瘤及室管膜腫瘤整合病理診斷的推薦流程分別如圖1~4所示。

圖1成人型彌漫性膠質(zhì)瘤整合病理診斷流程

圖2 兒童型彌漫性膠質(zhì)瘤整合病理診斷流程

圖3 局限性星形細胞膠質(zhì)瘤整合病理診斷流程

圖4 室管膜腫瘤整合病理診斷流程

三、膠質(zhì)瘤分子檢測試劑的規(guī)范化管理

基于《體外診斷試劑分類規(guī)則》及《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》相關(guān)規(guī)定，分子檢測技術(shù)所使用的試劑應(yīng)按照體外診斷試劑(in vitro diagnostic reagent)在市級藥品監(jiān)督管理部門進行備案管理，或由國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration,NMPA)審查進行注冊管理。目前國內(nèi)免疫組織化學抗體、FISH探針及IDH1/TERT/BRAF基因突變檢測試劑具備備案證或注冊證，其余檢測技術(shù)如二代測序、DNA甲基化譜尚無獲證產(chǎn)品。

共識1：按照國家醫(yī)療器械管理規(guī)定，分子檢測項目應(yīng)優(yōu)先使用具有醫(yī)療器械注冊證或進行備案的試劑。在國內(nèi)尚無同品種產(chǎn)品上市的體外診斷試劑時，可以通過實驗室自建項目(LDT)在本單位由醫(yī)師指導(dǎo)下開展（推薦等級：強烈推薦）。

表1 膠質(zhì)瘤常用的分子檢測指標

注：a各分子檢測指標的詳細內(nèi)容以2021年中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤WHO分類第5版的相應(yīng)描述為準

四、膠質(zhì)瘤分子檢測的常用技術(shù)

1. 免疫組織化學標記技術(shù)

Part.1

免疫組織化學通過GFAP、Olig2等抗體組合，對于確定腫瘤起源具有重要意義；一些檢測關(guān)鍵突變蛋白的抗體(如IDH1 R132H、BRAF V600E、H3 K27M、H3 G34R、H3 G34V等)對特定腫瘤類型的診斷具有關(guān)鍵提示作用。一些基因突變或融合可使其編碼蛋白表達缺失(ATRX陰性)、異常蓄積（p53強陽性）、甲基化障礙(H3 K27me3陰性)或過表達(p65陽性)，可作為分型診斷的重要或輔助標準之一。應(yīng)注意設(shè)置陽性和陰性對照，可借助內(nèi)皮細胞等作為內(nèi)部陽性對照。突變型抗體的陰性結(jié)果需要考慮到非經(jīng)典突變的可能。當出現(xiàn)免疫組織化學指標不典型時(H3K27me3瘤內(nèi)異質(zhì)性、GFAP/Olig2表達缺失等)，需要注意結(jié)合其他技術(shù)綜合評估。

共識2：特異性抗體組合可用于初篩，目前除組織學特征+IDH1 R132H突變抗體檢測陽性可直接診斷成人型IDH1突變型彌漫性膠質(zhì)瘤外（同時有ATRX表達缺失診斷更可靠），其他特征性指標建議結(jié)合其他分子檢測技術(shù)進行進一步復(fù)核（推薦等級：強烈推薦）。

2. 熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

Part.1

在熒光聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescent polymerase chain reaction,FPCR)技術(shù)中，目前在膠質(zhì)瘤應(yīng)用比較廣泛的主要是檢測已知突變位點的擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR(amplification refractory mutation system PCR,ARMS-PCR)和檢測甲基化狀態(tài)的定量甲基化特異性PCR(quantitative methylation specific PCR)。其檢測靈敏度好，適用于多數(shù)機構(gòu)開展，可用于部分免疫組織化學結(jié)果的驗證。但應(yīng)注意PCR技術(shù)可能存在漏檢罕見位點的可能，如IDH1的其他突變形式及IDH2突變，注意結(jié)合其他指標綜合診斷。MGMT基因啟動子甲基化是應(yīng)用替莫唑胺的伴隨診斷標志物，建議優(yōu)先使用具有三類醫(yī)療器械注冊證的檢測試劑盒進行檢測以指導(dǎo)臨床決策。

共識3：基于PCR技術(shù)的檢測平臺建議用于具有明確熱點突變的基因(IDH1/IDH2/TERT/BRAF)和MGMT啟動子甲基化狀態(tài)的檢測，優(yōu)先使用獲NMPA批準的試劑盒進行檢測（推薦等級：強烈推薦）。

3. FISH技術(shù)

Part.1

FISH通過將熒光素標記的核酸探針與待測組織切片中核酸序列雜交，在熒光顯微鏡下進行相對定量及定位觀察，可以用于基因擴增、缺失、斷裂的判斷，也可用于粗略評估染色體臂狀態(tài)。雖然檢測指標單一，但時效性較好，是分子病理最常用的技術(shù)之一。

共識4：基于FISH平臺的染色體1p/19q共缺失、EGFR基因擴增、CDKN2A/2B基因純合性缺失、BRAF基因融合檢測可用于輔助病理診斷和WHO級別的判斷。但應(yīng)注意熒光探針的局限性，與組織病理特征不符時應(yīng)使用其他平臺進行驗證（推薦等級：強烈推薦）。

4. Sanger測序技術(shù)

Part.1

Sanger測序即一代測序，是一種經(jīng)典的測序技術(shù)，利用標記的ddNTP（雙脫氧三磷酸核苷）中斷DNA延長，通過毛細管電泳確定堿基序列。通過不同的引物，可以靈活檢測感興趣的核酸序列，并且確定具體突變序列。同時對于二代測序發(fā)現(xiàn)的致病性種系變異，基于Sanger測序的家系驗證也是較為經(jīng)濟實惠的檢測策略。

共識5：Sanger測序技術(shù)可用于IDH1/2、TERT、BRAF等基因熱點區(qū)域突變檢測及免疫組織化學結(jié)果復(fù)核，應(yīng)注意腫瘤細胞比例較低導(dǎo)致的假陰性（推薦等級：強烈推薦）。

5. 下一代測序技術(shù)

Part.1

通常稱二代測序技術(shù)，也稱為高通量測序技術(shù)，可以一次性檢測多個樣本的多種基因變異?；贒NA的二代測序常用于單核苷酸變異(SNV)及小片段插入/缺失(Indels)的檢測，也可以通過覆蓋融合變異的斷裂點區(qū)域，從而實現(xiàn)融合變異的檢測；基因的拷貝數(shù)變異可以基于生物信息分析算法進行判斷，通過增加染色體骨架探針覆蓋，對染色體層面的變異（如染色體1p/19q共缺失、全第7號染色體獲得、全第10號染色體缺失等）也可以進行較為準確地評估，同時還可發(fā)現(xiàn)重要基因的雙等位(biallelic)狀態(tài)；單腫瘤樣本借助生物信息分析算法可以評估潛在的致病性/可能致病性種系變異。

共識6：基于DNA二代測序技術(shù)可以檢測膠質(zhì)瘤相關(guān)驅(qū)動性基因變異、基因拷貝數(shù)變異及染色體狀態(tài)；基于RNA二代測序檢測對于融合變異檢出效能更高；DNA+RNA聯(lián)合檢測需要至少覆蓋WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中所涉及的體系/種系驅(qū)動性基因變異、融合、染色體及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)（推薦等級：強烈推薦）。

6. DNA甲基化譜技術(shù)

Part.1

DNA甲基化譜技術(shù)是通過DNA甲基化芯片檢測待測樣本中90萬個以上的甲基化位點狀態(tài)，再使用隨機森林或t-SNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding)聚類等機器學習算法，評估該樣本與既往明確病理診斷樣本在DNA甲基化譜上的相似性。在本共識所納入的27種膠質(zhì)瘤中，除了青少年多形性低級別神經(jīng)上皮腫瘤、具有MAPK通路變異的兒童型彌漫性低級別膠質(zhì)瘤等少數(shù)腫瘤分類外，多數(shù)腫瘤分類將DNA甲基化譜特征納入必要或理想診斷標準。

腫瘤早篩甲基化檢測流程

DNA甲基化譜同時可以評估染色體和特定基因的拷貝數(shù)變異及MGMT基因啟動子的甲基化狀態(tài)，對于特定融合變異(如BRAF-KIAA1549、FGFR3-TACC3等)具有一定提示作用。腫瘤細胞比例對DNA甲基化譜分類的準確性影響較大，推薦腫瘤細胞比例需大于70%（發(fā)生錯誤分類概率較低）；瘤組織中存在大量炎性細胞成分和低級別膠質(zhì)瘤較易出現(xiàn)錯誤分類；對于修正評分（隨機森林法）小于0.9及與參考集未完全重疊(t-SNE)的病例應(yīng)謹慎診斷。

共識7：DNA甲基化譜技術(shù)是大多數(shù)膠質(zhì)瘤分類的必要或理想診斷標準，可同時進行基因及染色體拷貝數(shù)變異評估，應(yīng)由熟悉DNA甲基化譜技術(shù)的病理醫(yī)師結(jié)合組織學特征和/或分子信息對結(jié)果進行解釋（推薦等級：強烈推薦）。

五、膠質(zhì)瘤分子檢測推薦路徑

在檢測平臺完備的機構(gòu)推薦使用免疫組織化學套餐進行初篩，對于有提示診斷方向的陽性指標，或考慮成人型彌漫性膠質(zhì)瘤患者，進一步利用常規(guī)分子病理平臺(PCR/FISH/Sanger測序)進行復(fù)驗；對于初篩無提示診斷，可以通過二代測序或者DNA甲基化譜技術(shù)進一步明確診斷。二代測序應(yīng)優(yōu)先應(yīng)用于未將DNA甲基化譜納入診斷標準的腫瘤（如青少年多形性低級別神經(jīng)上皮腫瘤）及具有潛在靶向治療機會的腫瘤（如嬰兒型大腦半球膠質(zhì)瘤）；DNA甲基化譜技術(shù)應(yīng)優(yōu)先用于將DNA甲基化譜特征納入必要診斷標準的腫瘤分類；對于依舊無法明確診斷的特殊疑難病例可使用另一種方法驗證。

共識8：優(yōu)先使用免疫組織化學指標進行初篩，再結(jié)合患者年齡、腫瘤部位、組織學形態(tài)、免疫組織化學指標，有診斷方向的優(yōu)先使用常規(guī)分子病理平臺進行復(fù)驗，綜合選用二代測序或DNA甲基化譜技術(shù)進一步明確，對于疑難病例有條件單位可進行二代測序+DNA甲基化譜聯(lián)合檢測（推薦等級：強烈推薦）。

六、臨床實踐中的注意事項

1. 腫瘤細胞比例評估

不同的檢測方法對基因突變頻率的靈敏度不同，故不同的檢測方法要求的腫瘤細胞比例也有所不同。對于PCR及二代測序，推薦腫瘤細胞占比≥20%；Sanger測序推薦腫瘤細胞占比≥30%；對于DNA甲基化譜檢測，推薦腫瘤細胞占比≥70%。當腫瘤細胞比例不足時，應(yīng)對腫瘤細胞進行富集，盡可能避免出血和壞死區(qū)域；若無法富集，應(yīng)及時與患者和送檢醫(yī)師溝通是否繼續(xù)檢測，并在報告中注明相關(guān)情況。

共識9：不同技術(shù)對于腫瘤細胞比例要求不同，進行分子檢測前需由病理醫(yī)師評估腫瘤細胞比例，對于存在檢測失敗風險的病例應(yīng)及時與患者及送檢醫(yī)師溝通（推薦等級：強烈推薦）。

2. 核酸質(zhì)控

核酸質(zhì)量對檢測結(jié)果的準確性至關(guān)重要，推薦優(yōu)先應(yīng)用NMPA批準或備案的核酸提取試劑盒對樣本進行核酸提取。提取完成后需對核酸質(zhì)量進行評估，包括核酸濃度、總量和純度；對于進行二代測序和DNA甲基化譜檢測的核酸樣本，還需進行DNA片段大小或降解程度的評估。若提取的核酸不符合質(zhì)控標準，應(yīng)重新進行核酸提取并再次評估；若依舊不合格，應(yīng)及時與患者和送檢醫(yī)師溝通是否繼續(xù)檢測，并在報告中注明質(zhì)控情況及檢測結(jié)果的局限性。

3. 檢測報告

檢測報告的可讀性和涵蓋內(nèi)容可能直接影響病理診斷結(jié)果。檢測報告應(yīng)包括患者及樣本信息、腫瘤細胞比例、檢測結(jié)果、技術(shù)方法及方法局限性，由病理醫(yī)師審核后簽發(fā)，需強調(diào)的內(nèi)容可以通過備注形式體現(xiàn)。二代測序檢測報告應(yīng)在技術(shù)方法處描述測序目標區(qū)域大小(panel size)，同時報告下機數(shù)據(jù)量、Q30、平均測序深度、有效測序深度、測序均一性等核心質(zhì)控數(shù)據(jù)。

共識10：不同檢測技術(shù)對于同一指標的結(jié)論可能存在不一致性，不一致病例建議使用第三種方法進行驗證后方能診斷（推薦等級：強烈推薦）。

共識11：二代測序及DNA甲基化譜報告應(yīng)包括檢測結(jié)果、基因拷貝數(shù)變異、染色體變異、檢測范圍及核心質(zhì)控數(shù)據(jù)等內(nèi)容，多組學整合報告應(yīng)形成綜合性的整合結(jié)論（推薦等級：強烈推薦）。

4. DNA甲基化譜臨床實踐

按照《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》，數(shù)據(jù)分析需在國內(nèi)完成，但國內(nèi)尚缺乏標準統(tǒng)一的聚類算法及參考集，這就要求國內(nèi)開展DNA甲基化譜檢測需自行建立參考病例集及聚類分析算法，并按照國家醫(yī)療器械管理規(guī)定進行性能確認；單次8個樣本的上樣要求對于非腦腫瘤?？漆t(yī)院的報告時效性提出更高要求，而建立區(qū)域檢測中心可能是解決方案之一。

共識12：鼓勵建立中國人群中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤DNA甲基化數(shù)據(jù)庫和標準聚類算法，規(guī)范臨床應(yīng)用（推薦等級：強烈推薦）。

5. 種系變異

基于腫瘤單樣本的DNA二代測序檢測可以發(fā)現(xiàn)潛在的致病性/可能致病性的種系變異。一項兒童高級別腫瘤的回顧性研究發(fā)現(xiàn)近10%的患者存在致病性/可能致病性的種系變異，對于有腫瘤家族史的患者可以通過一代測序技術(shù)或多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)在外周血白細胞樣本中驗證在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)的可疑種系突變，陽性病例應(yīng)進一步接受遺傳咨詢及家系分析。

共識13：進行DNA二代測序檢測時應(yīng)加入白細胞對照，以發(fā)現(xiàn)致病性或可能致病性的種系變異（推薦等級：強烈推薦）。

膠質(zhì)母細胞瘤中失調(diào)的分子信號通路和串擾

分子技術(shù)的迅猛發(fā)展，為膠質(zhì)瘤的精準診治提供了新的手段，也對神經(jīng)病理醫(yī)師提出了更高的要求，在掌握組織學形態(tài)及免疫組織化學特征時，也需要熟悉分子病理指標的意義及技術(shù)局限性。DNA甲基化譜的臨床應(yīng)用為我們發(fā)現(xiàn)新的腫瘤分型提供了新技術(shù)；單細胞組學、空間組學等技術(shù)的快速迭代，也為我們在單細胞層面上認識腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供了海量信息，其檢測成本的不斷下降，讓我們看到未來臨床應(yīng)用的曙光。

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來 源：基因智匯圈