導(dǎo)讀

2025年，拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎(jiǎng)授予兩位科學(xué)家：馬克斯?普朗克多學(xué)科科學(xué)研究所的德克?戈里希（Dirk G?rlich）與德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的史蒂文?L?麥克奈特（Steven L. McKnight），以表彰他們?cè)诮沂镜鞍踪|(zhì)序列中低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域（LCDs）的結(jié)構(gòu)與功能方面所取得的發(fā)現(xiàn)。

憑借大膽的想象力與精巧的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，兩位學(xué)者成功揭示了細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸與細(xì)胞組織的新原理。

伊夫林?施特勞斯 | 撰文

潘展 | 翻譯

通常，教科書聚焦于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與化學(xué)精密性，正是這些獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)使這些分子能夠執(zhí)行特定的生理功能。蛋白質(zhì)的多樣性源于其氨基酸的排列順序，每種氨基酸都會(huì)賦予蛋白質(zhì)獨(dú)特的屬性。

傳統(tǒng)認(rèn)為，LCDs僅由20 種氨基酸中的少數(shù)幾種構(gòu)成且結(jié)構(gòu)松散，因此被認(rèn)為幾乎無法承擔(dān)重要的生理任務(wù)。

然而，真核生物中約15%-20%的蛋白質(zhì)都含有這類結(jié)構(gòu)域，而戈里希與麥克奈特的研究證實(shí)，這些無序的LCDs能在細(xì)胞內(nèi)聚集，為多種生理活動(dòng)提供支持。

01

破解核運(yùn)輸悖論

真核細(xì)胞內(nèi)存在眾多膜包裹的區(qū)室，這些區(qū)室匯集了執(zhí)行不同的生理功能。細(xì)胞核便是常規(guī)細(xì)胞器之一，其周圍的核膜將核內(nèi)物質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)分隔開來。分子需通過一套高度選擇性的運(yùn)輸系統(tǒng)在兩個(gè)腔室之間往返，該系統(tǒng)依賴核孔復(fù)合體發(fā)揮作用。這些由蛋白質(zhì)構(gòu)成的通道貫穿核膜，形成核質(zhì)交換的通路。

21世紀(jì)初，核輸入過程的關(guān)鍵特征已逐漸明晰，小分子可自主通過核孔，大分子跨核運(yùn)輸必須依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。戈里希在從事博士后研究期間，發(fā)現(xiàn)了其中一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這是首個(gè)被證實(shí)能協(xié)助蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)穿過核孔進(jìn)入細(xì)胞核的因子。

目前已知，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還會(huì)與填充在核孔中央通道內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。這類蛋白質(zhì)被稱為核孔蛋白，其分子中含有密布著由苯丙氨酸（F）和甘氨酸（G）組成的二氨基酸基序的復(fù)雜度較低的區(qū)域。此外，這些被稱為“FG 重復(fù)序列” 的LCDs無論轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否攜帶“貨物”（即待運(yùn)輸分子）都能促進(jìn)其跨核移位，但當(dāng)時(shí)這一過程的具體機(jī)制仍不明確。

這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了一系列難題：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與貨物結(jié)合形成的復(fù)合體比貨物本身更大，但這種結(jié)合反而會(huì)加速貨物進(jìn)入細(xì)胞核；而且從常理來看，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與任何物質(zhì)（此處指核孔蛋白）結(jié)合都應(yīng)延緩運(yùn)輸進(jìn)程而非加快速度。

2001年，戈里希利用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其貨物蛋白對(duì)分子從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的流入過程進(jìn)行了測(cè)量。研究結(jié)果顯示，核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)空載或滿載轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力與速度遠(yuǎn)超此前預(yù)期。戈里希對(duì)這種高效轉(zhuǎn)運(yùn)能力感到驚嘆，但同時(shí)也困惑于兩個(gè)問題：一是為何大多數(shù)分子的進(jìn)入會(huì)受到限制；二是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如何突破這一限制。

他提出了一個(gè)模型：核孔蛋白的LCDs由于含有大量苯丙氨酸其本質(zhì)上具有疏水性，會(huì)通過相互結(jié)合減少與水的接觸。大分子只需克服排斥力就能穿過這層疏水壁。。

戈里希進(jìn)一步提出，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)與核孔蛋白的LCDs結(jié)合，進(jìn)而與LCDs內(nèi)部重復(fù)序列間的相互作用形成競(jìng)爭(zhēng)；在此過程中，LCDs中的氨基酸會(huì)彼此分離，轉(zhuǎn)而與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合。通過這種方式，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能融入由LCDs構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會(huì)圍繞遷移的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白閉合，即便通道內(nèi)存在大分子，仍能對(duì)其他大分子形成阻礙。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過核孔時(shí)，其后方的疏水鍵會(huì)重新形成。這種選擇性溶劑化機(jī)制既解釋了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為何能被高效運(yùn)輸，也闡明了為何無法與核孔蛋白篩網(wǎng)結(jié)合的分子會(huì)被阻擋在外。

由此可見，核孔的通透性與屏障作用存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。戈里希隨即著手驗(yàn)證這一具有前瞻性的機(jī)制。

02

假說逐漸被證實(shí)

次年，戈里希發(fā)表研究指出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有異常高的疏水性，且破壞核孔的疏水性會(huì)使其處于開放狀態(tài)。這些研究進(jìn)展證實(shí)了疏水性在分選過程中的作用，但并未直接證明他所假設(shè)的核孔內(nèi)存在特定物質(zhì)。

于是，他提取出一種已知核孔蛋白的LCDs，隨后在特定條件下一件既意外又令人振奮的事情發(fā)生了——該結(jié)構(gòu)域凝固形成了一種半透明凝膠，這與他此前預(yù)測(cè)的物質(zhì)形態(tài)完全一致。隨后他通過基因工程技術(shù)將該結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)苯丙氨酸都替換為非疏水性的絲氨酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改造后的蛋白質(zhì)始終保持液態(tài)。這一現(xiàn)象表明，疏水性是凝膠形成的關(guān)鍵因素。

這種凝膠模擬了核孔的識(shí)別功能，它會(huì)排斥無法自主通過核孔的測(cè)試蛋白，卻允許多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穿透并在其中擴(kuò)散。若未與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，大分子貨物蛋白幾乎會(huì)完全被阻擋在凝膠外。

2006年至2007年發(fā)表的這些研究結(jié)果令人震驚，但仍有疑問待解。其中最關(guān)鍵的一點(diǎn)是，尚無研究證實(shí)完整核孔復(fù)合體中的分子轉(zhuǎn)運(yùn)依賴于含LCDs核孔蛋白之間的結(jié)合作用，而這正是戈里希模型的核心要素。他希望在真實(shí)核孔復(fù)合體的環(huán)境中驗(yàn)證自己的觀點(diǎn)。

戈里希利用蛙卵提取物重組出核孔，并在2012年證實(shí)了核孔的通透性屏障依賴于富含苯丙氨酸的重復(fù)序列之間的疏水相互作用。這些實(shí)驗(yàn)不僅為他的假說提供了有力支持，還排除了當(dāng)時(shí)其他主流理論的可能性。

從無序到有序

三年后戈里希發(fā)表研究稱，在動(dòng)物、植物、真菌和原生生物等多種生物中均存在的一種核孔蛋白其LCDs能自發(fā)組裝成致密顆粒，而這些顆?？蔀檗D(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其貨物提供通行通道。這些細(xì)胞內(nèi)臨時(shí)形成的、形似液滴的懸浮核孔結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用。

2021年，戈里希發(fā)表了一篇說服力強(qiáng)的論文，為其核孔研究畫上了圓滿句號(hào)。他在該研究中證實(shí)，一種僅含F(xiàn)G重復(fù)序列的簡(jiǎn)單合成蛋白便能重現(xiàn)選擇性核輸入過程。他指出屏障的本質(zhì)是用一段含有12個(gè)氨基酸的LCDs序列重復(fù)52次，便呈現(xiàn)出了該屏障最關(guān)鍵的特性。

03

低復(fù)雜度，高影響力

麥克奈特的研究方向是基因調(diào)控，而非核孔，但他關(guān)注到了戈里希關(guān)于核孔蛋白異常凝膠化的論文。一次偶然的發(fā)現(xiàn)，讓他找到了具有相似自組裝特性的物質(zhì)。當(dāng)時(shí)，他正在尋找一種能刺激胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)的分子伴侶，于是他與合作者加藤雅人（Masato Kato）將這種異噁唑類化合物的衍生物與破碎的細(xì)胞混合，結(jié)果數(shù)百種蛋白質(zhì)都與該衍生物結(jié)合。初看這一結(jié)果似乎是災(zāi)難性的，因?yàn)樵摶瘜W(xué)物質(zhì)似乎在非特異性地結(jié)合蛋白質(zhì)。但麥克奈特注意到，這些被捕獲的分子中，有許多是存在于RNA顆粒中的RNA結(jié)合蛋白。

這些RNA結(jié)合蛋白有一個(gè)顯著的共同特征，即每種蛋白都含有一個(gè)序列復(fù)雜度較低的結(jié)構(gòu)域。與核孔蛋白類似，這些結(jié)構(gòu)域僅由20種氨基酸中的少數(shù)幾種構(gòu)成（不過具體氨基酸種類有所不同）。數(shù)十年前，麥克奈特就曾研究過LCDs——因?yàn)檫@類結(jié)構(gòu)域在許多蛋白質(zhì)中都賦予了蛋白質(zhì)激活基因的能力。但一直以來他始終未能闡明當(dāng)這些松散、無序的結(jié)構(gòu)域從細(xì)胞中提取出來后其具體功能究竟是什么。而如今，他竟意外地再次聚焦于LCDs。

為驗(yàn)證LCDs是否是RNA結(jié)合蛋白與異噁唑類化合物結(jié)合的關(guān)鍵，麥克奈特與加藤雅人從多種RNA結(jié)合蛋白中移除了這段氨基酸序列，或把這段移除的序列添加到一種通常不會(huì)與該化合物結(jié)合的測(cè)試分子上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LCDs既是二者結(jié)合的必要條件也是充分條件。在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的過程中他們發(fā)現(xiàn)，一種含LCDs的FUS蛋白會(huì)像戈里希研究的核孔蛋白一樣形成凝膠。進(jìn)一步研究證實(shí)LCDs同樣是FUS蛋白具備這一特性的關(guān)鍵。麥克奈特于2012年發(fā)表了這些研究成果。

麥克奈特的研究立即產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，因?yàn)樗珳?zhǔn)解釋了無膜富RNA 細(xì)胞器的形成基礎(chǔ)——這類細(xì)胞器形似液滴。此前，克利福德?布蘭溫（Clifford Brangwynne）、安東尼?海曼（Anthony Hyman）（二人均任職于德累斯頓馬克斯?普朗克分子細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)研究所）與弗蘭克?尤利希（Frank Jülicher，任職于德累斯頓馬克斯?普朗克復(fù)雜系統(tǒng)物理研究所）已觀察到這類細(xì)胞器的存在。在 2009年一篇具有重要意義的論文中，他們證實(shí)戈里希提出的相分離原理適用于一種名為P體的無膜富含RNA細(xì)胞器，且這種細(xì)胞器能快速溶解與凝聚。這些研究者推測(cè)，其他具有自組裝能力的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也依賴類似過程，但并未闡明這一過程背后的分子機(jī)制。

麥克奈特通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，由LCDs構(gòu)成的凝膠中存在細(xì)長(zhǎng)且均勻的纖維；X射線衍射結(jié)果則顯示這些纖維具有交叉β結(jié)構(gòu)的典型特征，這種結(jié)構(gòu)常見于阿爾茨海默病等疾病中出現(xiàn)的致病性淀粉樣纖維。在這種結(jié)構(gòu)中，蛋白質(zhì)鏈通過主鏈間的氫鍵堆疊排列。但與傳統(tǒng)淀粉樣纖維具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性不同，F(xiàn)US蛋白形成的聚集體會(huì)在去污劑作用下解體。

與此同時(shí)，麥克奈特注意到上述異噁唑衍生物會(huì)形成晶體，其表面有一系列凹槽，這些凹槽上氫供體與氫受體的分布模式極具特點(diǎn)，能完美適配展開的蛋白質(zhì)鏈。他在 2012年發(fā)表的論文中提出，細(xì)胞內(nèi)的LCDs正是通過類似的構(gòu)象相互作用聚集形成 RNA 顆粒。在他看來，LCDs在形成RNA顆粒時(shí)的相互作用雖不如形成凝膠時(shí)那樣廣泛、持久，但二者的化學(xué)基礎(chǔ)是相同的。這種可逆的聚集過程能讓功能性細(xì)胞結(jié)構(gòu)在需要時(shí)組裝，然后在完成功能后解體（見圖 B 部分）。

要使這一設(shè)想成立，麥克奈特需要證實(shí)LCDs間的相互作用具有生物學(xué)相關(guān)性。為此，他通過化學(xué)修飾暴露區(qū)域的方法，分別在凝膠中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)一種RNA結(jié)合蛋白——hnRNPA2的LCDs進(jìn)行了研究。2015年，他發(fā)表研究稱：該結(jié)構(gòu)域在凝膠、細(xì)胞核及液滴中呈現(xiàn)出相似的構(gòu)象。

為明確其原子層面的細(xì)節(jié)，麥克奈特與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）生物物理學(xué)家羅伯特?泰科（Robert Tycko）展開合作。固態(tài)核磁共振光譜分析顯示，F(xiàn)US蛋白的LCDs內(nèi)部存在一個(gè)交叉β結(jié)構(gòu)核心。

越來越多的證據(jù)表明，在健康活細(xì)胞中，LCDs正是通過上述相互作用結(jié)合，進(jìn)而執(zhí)行關(guān)鍵的生理功能，如2021年麥克奈特與泰科發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞骨架成分中間纖維中的LCDs在正常組裝狀態(tài)下也呈現(xiàn)出這種交叉β結(jié)構(gòu)。

04

弱相互作用的強(qiáng)大力量

2022年，麥克奈特通過一種創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方法，直接驗(yàn)證了蛋白質(zhì)主鏈間的氫鍵（交叉β結(jié)構(gòu)的核心特征）是否參與LCDs的組裝過程。調(diào)控這類氫鍵并非易事，因?yàn)閭鹘y(tǒng)基因工程方法只能改變氨基酸側(cè)鏈而無法作用于主鏈。為此，麥克奈特通過化學(xué)手段封閉主鏈中的氮原子以阻斷氫鍵形成，隨后檢測(cè)該操作是否會(huì)影響LCDs的聚集能力。實(shí)驗(yàn)中，他重點(diǎn)研究了LCDs中一個(gè)對(duì)相分離至關(guān)重要的區(qū)域。

這些實(shí)驗(yàn)及其他相關(guān)研究，精準(zhǔn)定位了主鏈氫鍵促進(jìn)相分離的作用位點(diǎn)，不僅明確了氫鍵在該過程中的核心參與地位，也進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)LCDs的相互作用依賴交叉β連接這一觀點(diǎn)。此外，單個(gè)氫鍵即可產(chǎn)生可測(cè)量效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了LCDs的自組裝過程處于一種臨界狀態(tài)，微小變化就能使其向聚集或解離方向傾斜。捕捉這些短暫的交叉β相互作用極具挑戰(zhàn)性，而麥克奈特采用的正是此類嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法。

值得注意的是，脯氨酸因其主鏈氮原子不具備形成氫鍵所需的氫原子而無法參與氫鍵形成。麥克奈特推測(cè)，脯氨酸或許能中斷交叉 β 氫鍵的連續(xù)形成從而防止蛋白質(zhì)發(fā)生毒性聚集。他猜想LCDs中用其他氨基酸替代脯氨酸的致病性突變或許能為這一觀點(diǎn)提供佐證。

為驗(yàn)證這一可能性他重點(diǎn)研究了一類點(diǎn)突變，神經(jīng)絲輕鏈蛋白NFL、tau蛋白、hnRNPA2蛋白這三種不同蛋白中的這類突變都是編碼基因中用其他氨基酸代替了脯氨酸，并分別導(dǎo)致三種疾?。哼z傳性神經(jīng)疾病夏科-馬里-圖思病、額顳葉癡呆以及佩吉特病。實(shí)驗(yàn)顯示，攜帶致病突變的肽段會(huì)發(fā)生聚集；而當(dāng)阻斷突變氨基酸主鏈的氫鍵形成能力后，肽段的正常行為得以恢復(fù)。這些研究結(jié)果表明，突變通過穩(wěn)定原本可逆的交叉β連接最終引發(fā)了這些疾病。

LCDs蛋白間固有的弱相互作用，為基礎(chǔ)生物學(xué)帶來了深遠(yuǎn)影響，因?yàn)樵S多生理過程需要靈活切換，需要在特定條件下啟動(dòng)又在環(huán)境改變時(shí)終止。短暫的相互作用恰好為這類調(diào)控提供了基礎(chǔ)，使生理過程可在外界信號(hào)引導(dǎo)下向特定方向轉(zhuǎn)變。盡管驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)瞬即逝的分子事件面臨巨大挑戰(zhàn)，但LCDs的作用機(jī)制圖景仍逐步變得清晰。

麥克奈特與戈里希的研究證實(shí)了蛋白質(zhì)組中相當(dāng)一部分——即15%-20%含LCDs的蛋白質(zhì)，能幫助細(xì)胞構(gòu)建靈活、可逆的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)超越了傳統(tǒng)膜包裹細(xì)胞器的局限，為細(xì)胞功能的組織與調(diào)控提供了全新的方式。他們的研究徹底改變了我們對(duì)生物學(xué)基本問題的認(rèn)知。

https://laskerfoundation.org/winners/structures-and-functions-of-low-complexity-domains/

青科沙龍第171期 | Nature-基于鄰近標(biāo)記反應(yīng)的抗原擴(kuò)增策略

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