研究概述

目前，臨界尺寸骨缺損的臨床修復(fù)仍面臨重大挑戰(zhàn)。自體骨移植雖被視為“金標準”，但仍存在供體有限、造成二次創(chuàng)傷及形態(tài)難以精準匹配缺損部位等局限。組織工程支架雖能填充缺損區(qū)域，卻常因內(nèi)部微環(huán)境不理想而難以支持細胞在缺損中心的有效遷移、增殖與成骨分化——傳統(tǒng)多孔支架的孔壁結(jié)構(gòu)會阻礙細胞活動，且缺乏動態(tài)適應(yīng)細胞行為的能力。另外，依賴外源性生長因子（如BMP-2）促進骨再生的方法成本高且有安全風險。因此，亟需開發(fā)一種無需外加生物活性因子、僅通過自身物理結(jié)構(gòu)即可有效募集內(nèi)源性干細胞并誘導(dǎo)其成骨分化的新型支架材料。近年來，受天然細胞外基質(zhì)（ECM）多孔、納米級和動態(tài)可適應(yīng)特性的啟發(fā)，科研人員聚焦于構(gòu)建兼具互連納米球結(jié)構(gòu)與細胞自適應(yīng)能力的三維打印水凝膠，以期實現(xiàn)高效、安全的骨再生。

基于此，本研究團隊開發(fā) 了一種新型3D打印的納米膠體明膠甲基丙烯酰（GelMA）水凝膠（簡稱nG水凝膠），其通過GelMA與泊洛沙姆F68共混后自組裝并光交聯(lián)形成互連納米球結(jié)構(gòu)。這種細胞可適應(yīng)性的微觀結(jié)構(gòu)不僅具有優(yōu)異的孔隙連通性，還能動態(tài)響應(yīng)細胞行為，顯著促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）在體外的浸潤、遷移、鋪展及成骨分化，表現(xiàn)為堿性磷酸酶（ALP）、RUNX2、I型膠原（COL-1）和骨鈣素（OCN）表達上調(diào)及鈣結(jié)節(jié)形成增強。在大鼠臨界尺寸顱骨缺損模型中，無需外源性生長因子，nG水凝膠即可有效募集內(nèi)源性CD29?/CD90?干細胞，顯著提升骨礦密度（BMD）和新骨再生。機制研究表明，其促成骨作用部分源于激活了整合素β1/黏著斑激酶（FAK）機械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路。該研究為臨床定制化修復(fù)大段骨缺損提供了一種具有轉(zhuǎn)化前景的“生物海綿”策略。

細胞適應(yīng)性 nG 水凝膠在骨再生中的應(yīng)用 示意圖

相關(guān)研究以“Three-Dimensional Printed Cell-Adaptable Nanocolloidal Hydrogel Induces Endogenous Osteogenesis for Bone Repair”為題，發(fā)表在《Biomaterials Research》。四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院李宇教授、四川大學(xué)華西醫(yī)院茍馬玲研究員、四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院趙志河教授為其共同通訊作者。

圖文結(jié)果

Figure 1、水凝膠的制備與表征。(A) 基于DLP的3D打印示意圖。(B) nG水凝膠的個性化3D打印能力。上行，3D打印的輸入圖像；下行，3D打印nG水凝膠的光學(xué)顯微照片。(C) 展示水凝膠形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)的照片和SEM圖像。(D) nG水凝膠中納米球的尺寸。(E) 水凝膠的AFM圖像。(F) 從AFM分析獲得的Ra和Rq。(G) nG水凝膠在1.5×SBF中礦化1天前后的EDS元素映射圖像。(H) 根據(jù)EDS分析，nG水凝膠中C、O、P和 Ca 的原子百分比。

Figure 2、nG水凝膠的生物相容性和生物降解性。(A) 活/死細胞染色。(B) 水凝膠在體內(nèi)的降解行為。黑圈表示水凝膠的原始大小。(C) 根據(jù)圖2B，在降解過程中剩余的水凝膠痕跡。(D) 植入1周后水凝膠周圍皮下組織的H&E染色。(E) 活/死細胞染色的定量分析。(F) 通過CCK-8測定法確定的細胞增殖能力。(G) 植入8周后相對剩余水凝膠面積的量化。

Figure 3、nG水凝膠促進了細胞的粘附、鋪展和遷移。(A) rBMSCs在水凝膠上培養(yǎng)3天后的粘附、鋪展和遷移情況。上行，CLSM圖像的3D和XY視圖；下行，SEM圖像。(B) rBMSCs在水凝膠內(nèi)培養(yǎng)3天后的鋪展和遷移情況。上行，CLSM圖像的3D和XY視圖；下行，SEM圖像。(C) 在nG水凝膠中通過SIM捕捉到的細胞的時間序列圖像。時間以小時:分鐘表示。(D) 根據(jù)(C)所示的細胞和nG水凝膠動態(tài)變化的示意圖。(E) 細胞在水凝膠上和內(nèi)部的粘附、鋪展和遷移的示意圖。

Figure 4、nG 水凝膠對 rBMSCs 成骨分化的促進作用。(A) ALP 和 ARS 的染色及定量分析。(B) rBMSCs 在兩周培養(yǎng)后的成骨基因表達。(C，D) nG 水凝膠中 RUNX2 和 OCN 的表達量分別升高。(E) RUNX2 和 OCN 的熒光強度。(F) 水凝膠中的細胞鋪展面積。(G) rBMSCs 在 nG 水凝膠中培養(yǎng)后表現(xiàn)出類似于成骨細胞的形態(tài)。

Figure 5、nG水凝膠在顱骨缺損區(qū)域招募干細胞。(A) 動物實驗示意圖。(B) CD29、CD90和SDF-1α的H&E染色和IHC染色。紅色箭頭指示陽性表達。F，纖維；H，水凝膠。(C) CD29+和CD90+細胞的數(shù)量以及SDF-1α的表達量。

Figure 6、大鼠顱骨臨界缺損的μCT分析。(A) 從μCT分析得到的3D重建。(B) BMD和BV/TV的定量分析。

Figure 7、顱骨缺損的組織學(xué)和免疫組化染色。(A) 手術(shù)后4周和10周的H&E和Masson染色。灰色箭頭指示缺損的邊界。紅色箭頭指示水凝膠內(nèi)的新骨沉積。(B，C) 分別為手術(shù)后4周和10周的OCN和COL-1免疫組化染色。紅色箭頭指示水凝膠內(nèi)細胞周圍的陽性表達。F，纖維；H，水凝膠；NB，新骨。

Figure 8、nG水凝膠上調(diào)ECM-細胞內(nèi)機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子。(A) 第3天在水凝膠中培養(yǎng)的細胞的整合素β1和pFAK的免疫熒光染色。(B) 第3天在水凝膠中培養(yǎng)的細胞的Itgb1和Ptk2基因表達分析。(C，D) 手術(shù)后7天和4周顱骨缺損區(qū)域的整合素β1和pFAK的IHC染色。紅色箭頭指示陽性表達。

結(jié)論

本研究開發(fā)了一種新型三維打印的納米膠體明膠甲基丙烯酰（GelMA）水凝膠（nG水凝膠），其通過GelMA與泊洛沙姆F68自組裝形成互連納米球結(jié)構(gòu)。該nG水凝膠具有優(yōu)異的孔隙連通性和細胞自適應(yīng)微結(jié)構(gòu)，無需外源性生長因子即可有效促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）的浸潤、遷移、鋪展及成骨分化，顯著上調(diào)ALP、RUNX2、COL-1和OCN等成骨標志物表達，并增強鈣結(jié)節(jié)形成。在大鼠臨界尺寸顱骨缺損模型中，nG水凝膠顯著招募內(nèi)源性CD29?/CD90?干細胞，促進新骨生成，提高骨密度。機制研究表明，其促成骨能力部分源于激活整合素β1/黏著斑激酶（FAK）機械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路。細胞自適應(yīng)型nG水凝膠展現(xiàn)出作為臨床可轉(zhuǎn)化策略用于個性化修復(fù)大段骨缺損的巨大潛力。

參考文獻

3D-Printed Cell-adaptable Nanocolloidal Hydrogel Induces Endogenous Osteogenesis for Bone Repair

Wenxin Lu、Li Li、Ruyi Wang、Yanting Wu、Yao Chen、Bowen Tan、Zhihe Zhao、Maling Gou、Yu Li

DOI：10.34133/bmr.0146

Biomaterials Research

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https://doi.org/10.34133/bmr.0146