在多發(fā)性硬化等神經(jīng)炎癥疾病中，巨噬細胞既能加劇損傷，也能促進修復，具體取決于它們所處的“狀態(tài)”。但哪些信號在真實體內(nèi)環(huán)境中決定這些狀態(tài)，一直不清楚。

基于此，2025年12月4日，慕尼黑大學Martin Kerschensteiner?研究團隊在nature neuroscience雜志發(fā)表了“In vivo CRISPR screen reveals regulation of macrophage states in neuroinflammation”揭示了體內(nèi)CRISPR篩選揭示神經(jīng)炎癥中巨噬細胞狀態(tài)的調(diào)控機制。

作者開發(fā)了一種基于可基因編輯祖細胞的體內(nèi)CRISPR篩選平臺，用于研究多發(fā)性硬化（MS）小鼠模型中巨噬細胞的調(diào)控機制。通過對100多個細胞因子受體和信號分子的篩選，發(fā)現(xiàn)干擾素-γ、TNF、GM-CSF 和 TGF-β 是巨噬細胞極化的關鍵調(diào)控因子。單細胞測序證實，移植的祖細胞能分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所有髓系細胞類型。結(jié)合生物傳感器，該方法還能在體內(nèi)實時監(jiān)測細胞因子對髓系細胞遷移、碎片清除和氧化活性的影響。跨物種和腦區(qū)的比較分析揭示了保守的神經(jīng)炎癥細胞因子特征，明確了驅(qū)動MS患者腦內(nèi)髓系細胞功能的核心信號通路。這一平臺為高分辨率解析巨噬細胞狀態(tài)提供了可擴展的新工具。

圖一 體內(nèi)CRISPR篩選鑒定出調(diào)控神經(jīng)炎癥病灶中巨噬細胞極化的細胞因子受體

為解析神經(jīng)炎癥中巨噬細胞狀態(tài)的調(diào)控機制，作者利用可基因編輯的 Hoxb8FL 造血祖細胞，在EAE中開展體內(nèi)混合CRISPR篩選。

這些細胞在體外編輯并初步分化后，于疾病早期注入小鼠，能有效遷入脊髓病灶（依賴CCR2），占病灶髓系細胞約15%并像內(nèi)源細胞一樣分化為 iNOS?（促炎）或Arg1?（抗炎）亞型。

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研究人員構(gòu)建了靶向64個細胞因子受體及45個下游信號分子的CRISPR文庫，在EAE高峰期分選不同極化狀態(tài)的移植細胞，通過 sgRNA 富集分析鑒定關鍵調(diào)控因子。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCR2是髓系細胞進入中樞所必需；干擾素γ受體和TNF受體驅(qū)動 iNOS? 極化，TGF-β受體1 抑制該過程；Arg1?極化由 TGF-β受體1和GM-CSF受體促進，但被干擾素γ受體1抑制。

該平臺實現(xiàn)了在體內(nèi)高通量、高分辨率地解析巨噬細胞功能的細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡。

圖二 細胞因子受體對巨噬細胞極化作用的驗證及其關鍵下游效應分子的鑒定

作者通過更精細的單基因敲除實驗，確認了在EAE中，有兩類細胞因子信號最關鍵：干擾素γ和TNF推動巨噬細胞變成“促炎”狀態(tài)（表達iNOS）；TGF-β 和 GM-CSF 則幫助巨噬細胞轉(zhuǎn)向“抗炎”狀態(tài)（表達Arg1）。

有意思的是，雖然IL-4和IL-10也能讓巨噬細胞變“抗炎”，但在疾病高峰期的小鼠體內(nèi)，它們其實并不起作用。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些信號各有“專屬通路”：干擾素γ靠JAK–STAT1，TNF靠IKK2，而TGF-β則依賴SMAD4來發(fā)揮作用。

作者又在另一種由TH17細胞引起的EAE模型中做了實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干擾素γ和TGF-β的作用始終相反、相互對抗：一個促炎、一個抗炎，在不同模型中都很穩(wěn)定。

總的來說，干擾素γ和TGF-β是調(diào)控大腦炎癥中巨噬細胞行為的“核心開關”，而其他信號則根據(jù)疾病類型或階段靈活調(diào)整作用。

圖三 Perturb-seq在單細胞水平揭示細胞因子對巨噬細胞的調(diào)控作用

為了更深入地理解這些關鍵細胞因子調(diào)控因子的作用，作者首先在體外生成骨髓來源的巨噬細胞，將其暴露于不同組合的細胞因子中并進行轉(zhuǎn)錄組分析。

研究發(fā)現(xiàn)，干擾素γ和TNF一起推動巨噬細胞變成促炎（iNOS?）狀態(tài)，而TGF-β和GM-CSF則共同促進抗炎（Arg1?）狀態(tài)。有意思的是，四種因子一起用時，反而產(chǎn)生最多的Arg1?細胞，說明巨噬細胞在體內(nèi)能靈活切換狀態(tài)。

為了看清這些因子如何影響巨噬細胞的分化，作者在多發(fā)性硬化小鼠病重時，對腦脊髓中的巨噬細胞做了單細胞測序并結(jié)合CRISPR敲除實驗（通過移植編輯過的Hoxb8FL細胞或骨髓嵌合體）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有實驗中都出現(xiàn)相同的巨噬細胞亞群，基因特征高度一致；

iNOS主要出現(xiàn)在早期炎癥型巨噬細胞（尤其是CXCL10 3簇），而Arg1多見于中晚期細胞，兩者基本不重疊；敲除對應受體后，極化變化與之前篩選結(jié)果完全吻合。

具體來看：沒了干擾素γ信號，巨噬細胞“卡”在早期單核樣狀態(tài)，促炎亞群減少；沒了TNF信號，細胞難以向晚期成熟；沒了TGF-β或GM-CSF信號則CXCL10?炎癥型巨噬細胞變少，細胞更快進入晚期狀態(tài)。

總之，這些細胞因子不僅決定巨噬細胞“開火”還是“滅火”，還精細調(diào)控它們在炎癥病灶中的發(fā)育路徑。

圖四 細胞因子受體的缺失在神經(jīng)炎癥中對巨噬細胞病灶消退功能產(chǎn)生差異性調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號促進巨噬細胞執(zhí)行“清理和修復”功能，而干擾素γ信號（通過IFNGR1）則抑制這一過程，這與之前在多種多發(fā)性硬化模型中觀察到的兩者相互拮抗的結(jié)果一致。

此外，TGFBR1 和 GM-CSF 受體（CSF2RA）都能激活“組織重塑”相關基因，說明它們在某些功能上可以協(xié)同作用。

特別值得注意的是，TGFBR1對脂質(zhì)代謝至關重要。在神經(jīng)炎癥中，巨噬細胞需要清除富含脂質(zhì)的髓鞘碎片，而缺失TGFBR1的巨噬細胞雖然吞噬能力正常，卻無法有效排出脂質(zhì)，導致細胞內(nèi)脂滴和膽固醇結(jié)晶堆積，形成類似“泡沫細胞”的促炎狀態(tài)并高表達標志物 GPNMB。

這些結(jié)果表明：TGF-β不僅推動抗炎和修復程序，還通過調(diào)控脂質(zhì)外排防止巨噬細胞“卡殼”變成有害的泡沫細胞。

最后，通過結(jié)合CRISPR編輯、單細胞測序和活體成像，全面揭示了巨噬細胞在體內(nèi)的分化和功能調(diào)控機制。無論是用Hoxb8FL細胞還是傳統(tǒng)骨髓嵌合體，結(jié)果高度一致，證明Hoxb8FL是研究巨噬細胞體內(nèi)行為的可靠工具。

總結(jié)

總之，作者建立了一種快速、可擴展且通用的體內(nèi)CRISPR篩選方法，用于解析驅(qū)動髓系細胞狀態(tài)的信號通路在不同組織區(qū)室和疾病模型中的作用，為深入理解人類疾病中髓系細胞的調(diào)控機制提供了重要見解，這是邁向理性設計靶向先天免疫細胞療法的關鍵一步。

文章來源

https://doi.org/10.1038/s41593-025-02151-6

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