在多發(fā)性硬化等神經(jīng)炎癥疾病中，巨噬細(xì)胞既能加劇損傷，也能促進(jìn)修復(fù)，具體取決于它們所處的“狀態(tài)”。但哪些信號在真實(shí)體內(nèi)環(huán)境中決定這些狀態(tài)，一直不清楚。

基于此，2025年12月4日，慕尼黑大學(xué)Martin Kerschensteiner?研究團(tuán)隊(duì)在nature neuroscience雜志發(fā)表了“In vivo CRISPR screen reveals regulation of macrophage states in neuroinflammation”揭示了體內(nèi)CRISPR篩選揭示神經(jīng)炎癥中巨噬細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控機(jī)制。

作者開發(fā)了一種基于可基因編輯祖細(xì)胞的體內(nèi)CRISPR篩選平臺，用于研究多發(fā)性硬化（MS）小鼠模型中巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。通過對100多個(gè)細(xì)胞因子受體和信號分子的篩選，發(fā)現(xiàn)干擾素-γ、TNF、GM-CSF 和 TGF-β 是巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵調(diào)控因子。單細(xì)胞測序證實(shí)，移植的祖細(xì)胞能分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所有髓系細(xì)胞類型。結(jié)合生物傳感器，該方法還能在體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞因子對髓系細(xì)胞遷移、碎片清除和氧化活性的影響?？缥锓N和腦區(qū)的比較分析揭示了保守的神經(jīng)炎癥細(xì)胞因子特征，明確了驅(qū)動MS患者腦內(nèi)髓系細(xì)胞功能的核心信號通路。這一平臺為高分辨率解析巨噬細(xì)胞狀態(tài)提供了可擴(kuò)展的新工具。

圖一 體內(nèi)CRISPR篩選鑒定出調(diào)控神經(jīng)炎癥病灶中巨噬細(xì)胞極化的細(xì)胞因子受體

為解析神經(jīng)炎癥中巨噬細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控機(jī)制，作者利用可基因編輯的 Hoxb8FL 造血祖細(xì)胞，在EAE中開展體內(nèi)混合CRISPR篩選。

這些細(xì)胞在體外編輯并初步分化后，于疾病早期注入小鼠，能有效遷入脊髓病灶（依賴CCR2），占病灶髓系細(xì)胞約15%并像內(nèi)源細(xì)胞一樣分化為 iNOS?（促炎）或Arg1?（抗炎）亞型。

腦聲常談建立了多個(gè)《動物模型構(gòu)建與行為評估》交流群，群內(nèi)分享各種經(jīng)典和前沿的行為范式，共同交流解決動物實(shí)驗(yàn)中遇到的棘手問題，避坑少走彎路！有需要的老師可以掃碼添加微信進(jìn)入討論群！

研究人員構(gòu)建了靶向64個(gè)細(xì)胞因子受體及45個(gè)下游信號分子的CRISPR文庫，在EAE高峰期分選不同極化狀態(tài)的移植細(xì)胞，通過 sgRNA 富集分析鑒定關(guān)鍵調(diào)控因子。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCR2是髓系細(xì)胞進(jìn)入中樞所必需；干擾素γ受體和TNF受體驅(qū)動 iNOS? 極化，TGF-β受體1 抑制該過程；Arg1?極化由 TGF-β受體1和GM-CSF受體促進(jìn)，但被干擾素γ受體1抑制。

該平臺實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)高通量、高分辨率地解析巨噬細(xì)胞功能的細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖二 細(xì)胞因子受體對巨噬細(xì)胞極化作用的驗(yàn)證及其關(guān)鍵下游效應(yīng)分子的鑒定

作者通過更精細(xì)的單基因敲除實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了在EAE中，有兩類細(xì)胞因子信號最關(guān)鍵：干擾素γ和TNF推動巨噬細(xì)胞變成“促炎”狀態(tài)（表達(dá)iNOS）；TGF-β 和 GM-CSF 則幫助巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)向“抗炎”狀態(tài)（表達(dá)Arg1）。

有意思的是，雖然IL-4和IL-10也能讓巨噬細(xì)胞變“抗炎”，但在疾病高峰期的小鼠體內(nèi)，它們其實(shí)并不起作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些信號各有“專屬通路”：干擾素γ靠JAK–STAT1，TNF靠IKK2，而TGF-β則依賴SMAD4來發(fā)揮作用。

作者又在另一種由TH17細(xì)胞引起的EAE模型中做了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干擾素γ和TGF-β的作用始終相反、相互對抗：一個(gè)促炎、一個(gè)抗炎，在不同模型中都很穩(wěn)定。

總的來說，干擾素γ和TGF-β是調(diào)控大腦炎癥中巨噬細(xì)胞行為的“核心開關(guān)”，而其他信號則根據(jù)疾病類型或階段靈活調(diào)整作用。

圖三 Perturb-seq在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞因子對巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用

為了更深入地理解這些關(guān)鍵細(xì)胞因子調(diào)控因子的作用，作者首先在體外生成骨髓來源的巨噬細(xì)胞，將其暴露于不同組合的細(xì)胞因子中并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。

研究發(fā)現(xiàn)，干擾素γ和TNF一起推動巨噬細(xì)胞變成促炎（iNOS?）狀態(tài)，而TGF-β和GM-CSF則共同促進(jìn)抗炎（Arg1?）狀態(tài)。有意思的是，四種因子一起用時(shí)，反而產(chǎn)生最多的Arg1?細(xì)胞，說明巨噬細(xì)胞在體內(nèi)能靈活切換狀態(tài)。

為了看清這些因子如何影響巨噬細(xì)胞的分化，作者在多發(fā)性硬化小鼠病重時(shí)，對腦脊髓中的巨噬細(xì)胞做了單細(xì)胞測序并結(jié)合CRISPR敲除實(shí)驗(yàn)（通過移植編輯過的Hoxb8FL細(xì)胞或骨髓嵌合體）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有實(shí)驗(yàn)中都出現(xiàn)相同的巨噬細(xì)胞亞群，基因特征高度一致；

iNOS主要出現(xiàn)在早期炎癥型巨噬細(xì)胞（尤其是CXCL10 3簇），而Arg1多見于中晚期細(xì)胞，兩者基本不重疊；敲除對應(yīng)受體后，極化變化與之前篩選結(jié)果完全吻合。

具體來看：沒了干擾素γ信號，巨噬細(xì)胞“卡”在早期單核樣狀態(tài)，促炎亞群減少；沒了TNF信號，細(xì)胞難以向晚期成熟；沒了TGF-β或GM-CSF信號則CXCL10?炎癥型巨噬細(xì)胞變少，細(xì)胞更快進(jìn)入晚期狀態(tài)。

總之，這些細(xì)胞因子不僅決定巨噬細(xì)胞“開火”還是“滅火”，還精細(xì)調(diào)控它們在炎癥病灶中的發(fā)育路徑。

圖四 細(xì)胞因子受體的缺失在神經(jīng)炎癥中對巨噬細(xì)胞病灶消退功能產(chǎn)生差異性調(diào)控

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號促進(jìn)巨噬細(xì)胞執(zhí)行“清理和修復(fù)”功能，而干擾素γ信號（通過IFNGR1）則抑制這一過程，這與之前在多種多發(fā)性硬化模型中觀察到的兩者相互拮抗的結(jié)果一致。

此外，TGFBR1 和 GM-CSF 受體（CSF2RA）都能激活“組織重塑”相關(guān)基因，說明它們在某些功能上可以協(xié)同作用。

特別值得注意的是，TGFBR1對脂質(zhì)代謝至關(guān)重要。在神經(jīng)炎癥中，巨噬細(xì)胞需要清除富含脂質(zhì)的髓鞘碎片，而缺失TGFBR1的巨噬細(xì)胞雖然吞噬能力正常，卻無法有效排出脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂滴和膽固醇結(jié)晶堆積，形成類似“泡沫細(xì)胞”的促炎狀態(tài)并高表達(dá)標(biāo)志物 GPNMB。

這些結(jié)果表明：TGF-β不僅推動抗炎和修復(fù)程序，還通過調(diào)控脂質(zhì)外排防止巨噬細(xì)胞“卡殼”變成有害的泡沫細(xì)胞。

最后，通過結(jié)合CRISPR編輯、單細(xì)胞測序和活體成像，全面揭示了巨噬細(xì)胞在體內(nèi)的分化和功能調(diào)控機(jī)制。無論是用Hoxb8FL細(xì)胞還是傳統(tǒng)骨髓嵌合體，結(jié)果高度一致，證明Hoxb8FL是研究巨噬細(xì)胞體內(nèi)行為的可靠工具。

總結(jié)

總之，作者建立了一種快速、可擴(kuò)展且通用的體內(nèi)CRISPR篩選方法，用于解析驅(qū)動髓系細(xì)胞狀態(tài)的信號通路在不同組織區(qū)室和疾病模型中的作用，為深入理解人類疾病中髓系細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制提供了重要見解，這是邁向理性設(shè)計(jì)靶向先天免疫細(xì)胞療法的關(guān)鍵一步。

文章來源

https://doi.org/10.1038/s41593-025-02151-6

腦聲小店基于深度科研洞察，專注為動物實(shí)驗(yàn)提供"簡器械·精實(shí)驗(yàn)"解決方案。我們突破高精設(shè)備局限，開發(fā)手工定制化儀器及配件，通過科研巧思將基礎(chǔ)工具轉(zhuǎn)化為創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案。產(chǎn)品涵蓋行為學(xué)裝置、操作輔助工具等，使實(shí)驗(yàn)室在保持操作簡效的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)精細(xì)化數(shù)據(jù)采集，助力科研人員以創(chuàng)造性思維發(fā)掘簡易儀器的潛在科研價(jià)值。