研究背景

轉(zhuǎn)移仍是癌癥的一個(gè)常見(jiàn)特征，也是大多數(shù)癌癥相關(guān)死亡的原因。盡管已知原發(fā)性腫瘤每天會(huì)向循環(huán)系統(tǒng)中釋放數(shù)千個(gè)細(xì)胞，但僅有少數(shù)細(xì)胞能夠存活并形成轉(zhuǎn)移灶，這表明歸巢至遠(yuǎn)處部位并進(jìn)行定植是轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的主要瓶頸。成功的轉(zhuǎn)移定植需要克服來(lái)自外界敵對(duì)微環(huán)境的限制，尤其是免疫監(jiān)視。播散性腫瘤細(xì)胞（DTCs）可被宿主免疫細(xì)胞（主要是CD8?T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞[NK細(xì)胞]）識(shí)別并清除。然而，與原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的免疫編輯相比，人們對(duì)于外滲的腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移定植和生長(zhǎng)期間與局部免疫細(xì)胞之間的相互作用了解甚少。

研究方法

本研究分別在免疫系統(tǒng)完整與T細(xì)胞缺陷的情況下，利用小鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行體內(nèi)CRISPR文庫(kù)篩選，使用一個(gè)定制的單向?qū)NA（sgRNA）文庫(kù)，該文庫(kù)包含人類癌癥中頻繁突變的基因，鑒定出了在轉(zhuǎn)移定植過(guò)程中對(duì)腫瘤免疫逃逸至關(guān)重要的基因，并采用多種實(shí)驗(yàn)方法深入探究了其內(nèi)在作用機(jī)制。

研究結(jié)果

1. T細(xì)胞限制DTCs的肺轉(zhuǎn)移

研究人員靜脈注射不同數(shù)量Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞建立癌癥轉(zhuǎn)移免疫監(jiān)視模型，并通過(guò)活體顯微CT（Micro-CT）監(jiān)測(cè)肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示：C57BL/6J小鼠注射少于400萬(wàn)個(gè)細(xì)胞時(shí)無(wú)法形成肺轉(zhuǎn)移灶，而所有注射200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的T細(xì)胞缺陷型BALB/c裸鼠均發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。通過(guò)中和抗體構(gòu)建T細(xì)胞剔除模型證實(shí)，剔除CD4? T和CD8? T細(xì)胞后，C57BL/6J小鼠肺轉(zhuǎn)移得以重現(xiàn)，表明T細(xì)胞免疫對(duì)Hepa1-6細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植具有關(guān)鍵限制作用。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與C57BL/6J小鼠的正常肺組織相比，轉(zhuǎn)移瘤中CD4? T細(xì)胞、CD8? T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（FoxP3? CD4?）及耗竭性（PD-1?）CD8? T細(xì)胞數(shù)量顯著增加。

2. 免疫應(yīng)激下轉(zhuǎn)移抑制因子的體內(nèi)CRISPR篩選

基于該肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，通過(guò)CRISPR文庫(kù)篩選鑒定調(diào)控DTCs免疫逃逸的關(guān)鍵基因。初步全基因組篩選（覆蓋19,674個(gè)基因）顯示：在T細(xì)胞缺陷小鼠中成功誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移，但在免疫健全小鼠中未發(fā)現(xiàn)顯著富集的基因突變，提示在免疫壓力下難以篩選到轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)基因。為提高篩選效率，進(jìn)而構(gòu)建了靶向161個(gè)癌癥相關(guān)基因的定制文庫(kù)（mDriverV1）。注射mDriverV1感染的Hepa1-6細(xì)胞后，33%的免疫健全小鼠形成肺轉(zhuǎn)移灶（n=50），而對(duì)照組無(wú)轉(zhuǎn)移發(fā)生，證明該策略可有效識(shí)別在免疫壓力下促進(jìn)轉(zhuǎn)移定植的關(guān)鍵基因。

3. Sgk1缺失通過(guò)逃逸T細(xì)胞介導(dǎo)的清除驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移

通過(guò)對(duì)野生型（WT）和T細(xì)胞缺失小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，并設(shè)定sgRNA豐度、多條獨(dú)立sgRNA靶向及跨小鼠重復(fù)性三重標(biāo)準(zhǔn)篩選候選基因。最終鑒定出共有15個(gè)基因（被39條sgRNA靶向）在WT小鼠中富集，9個(gè)基因（被32條sgRNA靶向）在T細(xì)胞剔除小鼠中富集，其中Sgk1在WT小鼠中評(píng)分最高。SGK1是一種在細(xì)胞應(yīng)激中發(fā)揮重要作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。通過(guò)CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建了Sgk1-KO的Hepa1-6細(xì)胞系并驗(yàn)證其敲除效率，功能驗(yàn)證顯示：在免疫健全小鼠中，Sgk1-KO細(xì)胞能形成肺轉(zhuǎn)移灶，而對(duì)照組不能；反之，在Sgk1低表達(dá)的MC38結(jié)腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sgk1則顯著抑制其肺轉(zhuǎn)移能力。在T細(xì)胞缺失的情況下，注射Sgk1-OE或Vector細(xì)胞的小鼠所形成的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量無(wú)顯著差異，表明Sgk1通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)清除的敏感性來(lái)抑制轉(zhuǎn)移定植。

4. SGK1在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)降低并與不良預(yù)后相關(guān)

臨床分析表明，SGK1在肝癌肺轉(zhuǎn)移灶中的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)應(yīng)的原發(fā)灶，該現(xiàn)象在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和胰腺導(dǎo)管癌中同樣存在。單細(xì)胞測(cè)序顯示循環(huán)腫瘤細(xì)胞中SGK1表達(dá)亦降低。同時(shí)，SGK1高表達(dá)與細(xì)胞毒性CD8? T細(xì)胞浸潤(rùn)減少、T細(xì)胞耗竭比例升高相關(guān)。對(duì)116例肝癌患者隨訪發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤SGK1低表達(dá)預(yù)示著更短的總生存期和更高的肝外轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)過(guò)多因素分析確認(rèn)其是獨(dú)立預(yù)后因素，TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證Sgk1的預(yù)后價(jià)值適用于多種癌種。

5. 腫瘤細(xì)胞中Sgk1的缺失通過(guò)干擾TNF-α和IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)減輕CD8? T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷

敲除Sgk1不影響腫瘤細(xì)胞增殖能力，但顯著增強(qiáng)其對(duì)CD8? T細(xì)胞殺傷的抵抗。這種抵抗作用具有細(xì)胞自主性，且依賴于Sgk1的激酶活性——回補(bǔ)野生型Sgk1可恢復(fù)敏感性，而激酶失活突變體（S422A）則無(wú)效。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，Sgk1缺失或激酶活性喪失會(huì)特異性抑制由CD8? T細(xì)胞激活的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/核因子κB(NF-κB)和干擾素-γ（IFN-γ）信號(hào)通路。機(jī)制研究表明，Sgk1通過(guò)其激酶活性調(diào)控T細(xì)胞來(lái)源的TNF-α/IFN-γ所介導(dǎo)的殺傷作用：細(xì)胞因子刺激可增強(qiáng)其底物NDRG1的磷酸化，而激酶失活型SGK1無(wú)法介導(dǎo)此過(guò)程，且使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子殺傷產(chǎn)生抵抗。這些發(fā)現(xiàn)證明，Sgk1通過(guò)調(diào)控TNF-α/IFN-γ信號(hào)通路，直接影響腫瘤細(xì)胞對(duì)CD8? T細(xì)胞殺傷的敏感性，其激酶活性是介導(dǎo)該作用的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。

6. SGK1激酶活性缺失減弱RIPK1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡

Sgk1缺失顯著降低了死亡受體介導(dǎo)的RIPK1磷酸化激活，同時(shí)Sgk1與RIPK1存在直接相互作用。功能實(shí)驗(yàn)表明，SGK1缺失或RIPK1抑制均能顯著減弱TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且同時(shí)敲除SGK1與RIPK1不再產(chǎn)生疊加效應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，SGK1通過(guò)調(diào)控RIPK1依賴性基因網(wǎng)絡(luò)影響IFN-γ應(yīng)答和TNF-α信號(hào)通路。這些結(jié)果證明SGK1通過(guò)與RIPK1相互作用并調(diào)控其磷酸化，從而介導(dǎo)CD8? T細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死。

7. SGK1-KO轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)將微環(huán)境重塑為終末耗竭狀態(tài)

SGK1缺陷腫瘤細(xì)胞通過(guò)重塑免疫微環(huán)境實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示，與對(duì)照組相比，Sgk1-KO轉(zhuǎn)移灶中T細(xì)胞比例顯著降低，且CD8? T細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的耗竭特征：高表達(dá)Lag3、Ctla4、Pdcd1等耗竭標(biāo)志物，而細(xì)胞毒性特征（Gzmk、Prf1、Nkg7）顯著減弱。擬時(shí)序分析可知，Sgk1-KO轉(zhuǎn)移灶中的CD8? T細(xì)胞主要處于終末耗竭狀態(tài)，而對(duì)照組則多為祖細(xì)胞耗竭狀態(tài)。這一發(fā)現(xiàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)得到驗(yàn)證，證實(shí)Sgk1-KO轉(zhuǎn)移灶中PD-1?TIM-3?CD8? T細(xì)胞顯著富集。綜上可知，SGK1缺失通過(guò)誘導(dǎo)CD8? T細(xì)胞終末耗竭，塑造了有利于腫瘤免疫逃逸的微環(huán)境。

8. Sgk1-KO轉(zhuǎn)移灶對(duì)治療性免疫治療不敏感但對(duì)預(yù)防性免疫治療敏感

Sgk1-KO轉(zhuǎn)移灶對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的治療響應(yīng)取決于干預(yù)時(shí)機(jī)。在模擬臨床治療（腫瘤注射后3周開始給藥）時(shí)，抗PD-1/LAG-3抗體對(duì)Sgk1-KO轉(zhuǎn)移灶無(wú)效，但對(duì)對(duì)照組有效。證明Sgk1缺失的轉(zhuǎn)移灶對(duì)ICIs抵抗，而表達(dá)Sgk1的轉(zhuǎn)移灶對(duì)治療性免疫治療有反應(yīng)。而預(yù)防性干預(yù)（接種當(dāng)天給藥）能顯著抑制Sgk1-KO細(xì)胞轉(zhuǎn)移，抗PD-1抗體甚至可實(shí)現(xiàn)腫瘤完全消退。這一現(xiàn)象在H22和Hep53.4細(xì)胞系中得到驗(yàn)證。機(jī)制分析表明，Sgk1沉默的轉(zhuǎn)移腫瘤對(duì)治療性ICI無(wú)效可能與病灶中富集終末耗竭CD8? T細(xì)胞有關(guān)，而早期干預(yù)可有效阻斷轉(zhuǎn)移定植。

9. SGK1是轉(zhuǎn)移性HCC患者對(duì)ICI應(yīng)答的預(yù)測(cè)因子

對(duì)11例接受抗PD-1治療的肝癌肺轉(zhuǎn)移患者分析顯示，治療應(yīng)答組的腫瘤組織SGK1表達(dá)水平顯著高于無(wú)應(yīng)答組，表明SGK1可作為預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的潛在生物標(biāo)志物。

研究結(jié)論

本研究揭示體內(nèi)CRISPR篩選鑒定出Sgk1是抑制肝癌轉(zhuǎn)移定植的關(guān)鍵因子，Sgk1缺失會(huì)抑制CD8? T細(xì)胞誘導(dǎo)的RIPK1依賴性壞死性凋亡，賦予轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞生存優(yōu)勢(shì)。Sgk1沉默的轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)促進(jìn)終末耗竭CD8? T細(xì)胞的浸潤(rùn)，形成免疫抑制微環(huán)境。而這種情況可在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植早期階段施用ICIs來(lái)逆轉(zhuǎn)，而晚期治療性干預(yù)則因微環(huán)境不可逆而失效。臨床分析證實(shí)，Sgk1低表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)，且其表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的可靠生物標(biāo)志物。該研究不僅闡明了Sgk1調(diào)控腫瘤免疫逃逸的新機(jī)制，還為針對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移中T細(xì)胞免疫抵抗的潛在治療策略提供了寶貴見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：

Zhang Z, Geng C, Song M, et al. Loss of SGK1 supports metastatic colonization in hepatocellular carcinoma by promoting resistance to T cell-mediated immunity. J Hepatol. 2025;83(2):397-410.

審批編號(hào)：CN-174480

有效期至：2026/12/10

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